CN102083303A

CN102083303A - 抗除草剂的草类物种的开发

Info

Publication number: CN102083303A
Application number: CN2009801230493A
Authority: CN
Inventors: 保罗·L·雷默; 道格拉斯·赫卡特; 韦恩·艾伦·帕罗特
Original assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2011-06-01
Also published as: WO2009155580A1; US20100048405A1; EP2302998A1; EP2302998A4; AU2009259882A1; MX2010014147A; AU2009259882A2; AR072283A1; ZA201009067B

Abstract

本发明涉及一种选择和培养的来自黍亚科(Panicodae)群组的抗乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂除草剂的植物，或其组织、种子或子代，和选择所述植物的方法。本发明还涉及控制抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物附近的杂草的方法。

Description

抗除草剂的草类物种的开发

技术领域

本文所揭示的本发明大致涉及对选择性除草剂具有抗性的草类和开发所述草类的方法。

背景技术

海雀稗(Seashore paspalum/Paspalum vaginatum)是一种温季草坪草，一般适合于沙丘环境。海雀稗的有利性质包括其对盐、水浸和干旱的耐受性。这些特征使得雀稗属(paspalum)成为用于任何或所有这些环境问题都会成为问题的比赛场地的优质草坪草候选者。举例来说，高尔夫球场设计师推荐海雀稗用于盐或水质会影响草坪草生长和维护的热带或亚热带沿海地区的新球场。另外，许多现有的高尔夫球场已用雀稗属替代狗牙根(bermudagrass/Cynodon dactylon)。与狗牙根相比，雀稗属需要的氮气更少并且对用含盐或劣质水冲洗的耐受性更好，这会降低管理成本并改善冲冼灵活性。

用雀稗属替代狗牙根的主要局限性是狗牙根的重新建植。狗牙根具有高竞争性并且一旦建植就难以去除。狗牙根和其它似杂草的草类会大大降低雀稗属草坪的审美价值和质量。因此，需要控制或限制雀稗属繁殖区中的狗牙根或似杂草的草类生长。为控制雀稗属繁殖草坪草区中的似杂草的草类的生长，需要开发对选择性除草剂具有抗性的雀稗属草坪草。过去开发抗除草剂的草坪草的方法包括使用基因工程方法。然而，由于政府关于使用基因改造植物的条例和限制，因此通过基因工程方法制造的植物可能难以商业化。因此，本发明的实施例包括开发对除草剂具有非转基因抗性的草坪草栽培品种，以及具有转基因抗性的栽培品种。

发明内容

本发明的实施例涉及一种选择和培养的来自黍亚科群组的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物，或其组织、种子或子代。在一些实施例中，从已经历选择方法的抗除草剂的未分化细胞再生抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物，其中所述选择方法包括：从黍亚科群组的植物提供未分化细胞的愈合组织，使所述愈合组织与足以延缓生长或杀死愈合组织的量的至少一种除草剂接触，基于所述除草剂的不同作用选择至少一种抗性细胞，和从所述至少一种抗性细胞再生所述品种的能生存的整个植物。在一些实施例中，所述植物是非转基因植物。

在本发明的一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物是黍族(Paniceae)的成员。在一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物是一种选自以下的群组的植物：地毯草属(Axonopus)(地毯草(carpetgrass))、马唐属(Digiteria)(马唐草(crabgrass))、稗属(Echinochloa)、黍属(Panicum)、雀稗属(Paspalum)(百喜草(Bahiagrass))、狼尾草属(Pennisetum)、狗尾草属(Setaria)和钝叶草属(Stenotaphrum)(圣奥古斯丁草(St.Augustine grass))。在一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物是一种选自以下的群组的植物：海雀稗(seashore paspalum/P.vaginatum)、剪股颖属草(bent grass)、高羊茅草(tall fescue grass)、结缕草(Zoysiagrass)、狗牙根(狗牙根属(Cynodon spp))、草地早熟禾(Kentucky Bluegrass)、得克萨斯早熟禾(Texas Bluegrass)、黑麦草(Perennial ryegrass)、野牛草(buffalograss/Buchloe dactyloides)、百足草(假俭草(Eremochloa ophiuroides))和圣奥古斯丁草(偏序钝叶草(Stenotaphrum secundatum))、地毯草(地毯草属)和百喜草(Bahiagrass/Paspalum notatum)。

在本发明的一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物对乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂具有抗性。在一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物对环己二酮除草剂、丙酸芳氧基苯氧酯除草剂、苯基吡唑啉除草剂或其混合物具有抗性。在一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物对至少一种选自以下的群组的除草剂具有抗性：禾草灭(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、氯丙氧定(cloproxydim)、环苯草酮(profoxydim)、稀禾定(sethoxydim)、环苯草酮(clefoxydim)、克草同(clethodim)、环杀草(cycloxydim)、得杀草(tepraloxydim)、苯草酮(tralkoxydim)、炔禾灵(chloraizfop)、炔草酸(clodinafop)、氯伏草(clofop)、赛伏草(cyhalofop)、禾草灵(diclofop)、恶唑禾草灵(fenoxaprop)、噻唑禾草灵(fenthiaprop)、精吡氟禾草灵(fluazafop-butyl)、吡氟禾草灵(fluazifop)、合氯氟(haloxyfop)、异恶草醚(isoxapyrifop)、恶唑酰草胺(metamifop)、普拔草(propaquizafop)、快伏草(quizalofop)、三氟丙酸(trifop)和唑啉草酯(pinoxaden)。

在本发明的一些实施例中，抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物的除草剂抗性是通过乙酰辅酶A羧化酶基因的至少一个选自以下的群组的氨基酸位置的突变来赋予：1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099和2096。在一些实施例中，除草剂抗性是通过氨基酸位置1781的异亮氨酸突变成亮氨酸来赋予。

本发明的实施例还涉及一种如任一上述段落中所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物的子代。在一些实施例中，所述子代是抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物亲代有性繁殖的结果。在一些实施例中，所述子代是抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物亲代无性繁殖的结果。

本发明的实施例还涉及一种如任一上述段落中所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物的种子或其子代。

本发明的实施例涉及包含如任一上述段落中所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物或其子代或种子的草地。本发明的实施例还涉及一种包含如任一上述段落中所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物或其子代或种子的草坪草苗圃地。在本发明的实施例中，提供一种包含如任一上述段落中所述的抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物或其子代或种子的商业草坪、高尔夫球场或牧场。

本发明的实施例还涉及一种从黍亚科群组中鉴别抗除草剂植物的方法，其包括：从黍亚科群组的植物提供未分化细胞的愈合组织，使所述愈合组织与足以延缓生长或杀死愈合组织的量的至少一种除草剂接触，基于所述除草剂的不同作用选择至少一种抗性细胞，和从所述至少一种抗性细胞再生所述品种的能生存的整个植物，其中所述再生植物对至少一种除草剂具有抗性。在一些实施例中，所述方法进一步包括将至少一种抗性细胞扩增为多种未分化细胞。在一些实施例中，从非转基因植物提供未分化细胞的愈合组织。

在本发明的一些实施例中，方法中所提供的植物是一种选自黍族的植物。在一些实施例中，所述植物是一种选自以下的群组的植物：地毯草属(地毯草)、马唐属(马唐草)、稗属、黍属、雀稗属(百喜草)、狼尾草属、狗尾草属和钝叶草属(圣奥古斯丁草)。在一些实施例中，所述植物是一种选自以下的群组的植物：海雀稗、剪股颖属草(剪股颖属(Agrostis spp))、高羊茅草(tall fescue)、结缕草、狗牙根(狗牙根属)、草地早熟禾、得克萨斯早熟禾、黑麦草、野牛草、百足草(假俭草)和圣奥古斯丁草(偏序钝叶草)、地毯草(地毯草属)和百喜草。

在本发明的一些实施例中，方法中所使用的至少一种除草剂是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂。在一些实施例中，至少一种除草剂是选自以下的群组：禾草灭、丁苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸及唑啉草酯。

在本发明的一些实施例中，植物的除草剂抗性是通过乙酰辅酶A羧化酶基因的选自以下的群组的至少一个氨基酸位置的突变来赋予：1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099和2096。在一些实施例中，除草剂抗性是通过氨基酸位置1781的异亮氨酸突变成亮氨酸来赋予。

本发明的实施例还涉及一种抗除草剂植物的可再生细胞的组织培养，其是通过如上述段落中所述的方法来进行。

在本发明的实施例中，一种控制抗除草剂植物附近的杂草的方法，其中所述抗除草剂植物是通过上述段落中所述的方法来鉴别，所述方法包括：使至少一种除草剂与所述杂草和抗除草剂植物接触，其中所述至少一种除草剂是以足以抑制同一物种的非选择植物生长或足以抑制杂草生长的速率与杂草和植物接触。在一些实施例中，抗除草剂植物对乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂具有抗性。在一些实施例中，方法包括使除草剂直接与抗除草剂植物接触。在一些实施例中，方法包括使除草剂与抗除草剂植物所在的生长培养基接触。

在一些实施例中，抗除草剂植物对环己二酮除草剂、丙酸芳氧基苯氧酯除草剂、苯基吡唑啉除草剂或其混合物具有抗性。在一些实施例中，抗除草剂植物是非转基因植物。

在本发明的一些实施例中，植物的除草剂抗性是通过乙酰辅酶A羧化酶基因的至少一个选自以下的群组的氨基酸位置的突变来赋予：1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099和2096。在一些实施例中，除草剂抗性是通过乙酰辅酶A羧化酶基因的氨基酸位置1781的异亮氨酸突变成亮氨酸来赋予。

在一些实施例中，方法中所使用的至少一种除草剂是选自以下的群组：禾草灭、丁苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸及唑啉草酯。

本发明的实施例涉及一种以ATCC寄存编号________寄存的海雀稗特异性DNA标记，或其能够鉴别抗除草剂的草类栽培品种的片段。在一些实施例中，海雀稗特异性DNA标记包含SEQ ID NO：5或其片段。

本发明的实施例还涉及一种鉴别抗除草剂植物的方法，其包括：获得植物的遗传学样品，和测定所述样品中存在或不存在乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781的突变，其中存在位置1781的突变指示植物具有除草剂抗性。还涵盖乙酰辅酶A羧化酶的位置1781的标记在鉴别抗除草剂植物的方法中的用途。

本发明的实施例涉及一种标记辅助育种的方法，其包括以下步骤：鉴别所关注用于育种和选择的特征，其中所述特征与乙酰辅酶A羧化酶基因有关；提供带有能够赋予植物对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的抗性的乙酰辅酶A羧化酶序列变异体的第一植物，其中所述植物进一步包含所关注之特征；用第二植物培育所述第一植物；鉴别育种步骤的子代为具有所述乙酰辅酶A羧化酶序列变异体；和基于所述鉴别步骤选择可能具有所关注的特征的子代。在一些实施例中，所述特征选自：性状或基因。在一些实施例中，所述性状是至少一种选自由以下组成的群组的性状：除草剂耐受性、疾病抗性、害虫昆虫抗性、脂肪酸改变、蛋白质或碳水化合物代谢、生长速率增加、胁迫耐受性增强、优先成熟、感官性质增强、形态特征改变、不能繁殖、其它农业性状、工业用途的性状或改善消费者吸引力的性状。

在本发明的一些实施例中，方法中所包括的乙酰辅酶A羧化酶序列变异体包括以下至少一个位置的变化：1756、1783、1999、2027、2041、2078、2099和2096。在一些实施例中，植物抗性所针对的除草剂是至少一种选自以下的群组的除草剂：禾草灭、丁苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸及唑啉草酯.

在一些实施例中，方法中所包括的鉴别步骤包括选自以下的过程：序列变异体的分子检测、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂抗性的观察和通过应用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂进行选择。

本发明的实施例涉及一种用包含具有从ATCC寄存编号__________的序列衍生的至少250个碱基的DNA区段转化的转基因植物，和其子代植物。在一些实施例中，所述子代植物选自：回交子代、杂交、克隆子代和同胞交配子代。在一些实施例中，所述DNA区段包含从SEQ ID NO：5衍生的至少个250碱基。

本发明的实施例还涉及一种含有包含从ATCC寄存编号_________的序列衍生的至少250个碱基的DNA区段的转化细胞。在一些实施例中，所述DNA区段包含从SEQ ID NO：5衍生的至少个250碱基。

在本发明的实施例中，提供一种鉴别乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781的突变的方法，所述方法包括从细胞获得遗传学样品，通过在扩增步骤中使用SV384F引物和SV348R引物来选择性扩增DNA片段，和对所述DNA片段测序以确定存在或不存在乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781的突变，其中DNA片段中存在突变指示细胞中存在位置1781的突变。

附图说明

所属领域的技术人员应了解下文所述的图示仅用于说明性目的。所述图示无论如何也不打算限制本发明教示的范围。

图1是植物的脂肪酸生物合成路径的图。

图2是用于如本文所揭示的选择非转基因抗除草剂植物的除草剂选择方案的一实施例的说明。

图3是说明海雀稗的稀禾定剂量-反应曲线的图。

图4是生长于含有稀禾定的愈合组织诱发培养基上的海雀稗的抗稀禾定愈合组织的照片。

图5是一系列色谱图，其说明如本文所揭示而选择的抗除草剂海雀稗植物的乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781的氨基酸突变。

图6是说明在处理后7天(DAT)对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物对Segment^TM稀禾定的反应的照片。

图7是说明在处理后7天(DAT)Segment^TM稀禾定对对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物的损伤的图。

图8是说明在处理后14天(DAT)对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物对Segment^TM稀禾定的反应的照片。

图9是说明在处理后9天(DAT)Segment^TM稀禾定对对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物的损伤的图。

图10是说明在处理后21天(DAT)对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物对Segment^TM稀禾定的反应的照片。

图11是说明在处理后21天(DAT)Segment^TM稀禾定对对照植物和抗除草剂植物的损伤的图。

图12是说明在处理后42天(DAT)在用Segment^TM稀禾定处理后对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物的平均干重的图。

图13是说明在处理后21天(DAT)Poast^TM稀禾定对对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物的损伤的图。

图14是说明在处理后21天(DAT)Fusilade II^TM精吡氟禾草灵除草剂对对照植物和如本文所揭示而选择的抗除草剂植物的损伤的图。

图15是说明在处理后21天(DAT)Acclaim Extra^TM II精恶唑禾草灵(fenoxaprop-p-butyl)除草剂对对照植物和抗除草剂植物的损伤的图。

图16是由植物居间分生组织获得的愈合组织产生的一实施例的说明。

具体实施方式

对选择性除草剂的抗性可提供控制各种草坪草物种中的似杂草的草类的高效方法。已提出用于开发抗除草剂植物的基因工程方法，然而由于政府关于使用基因改造植物的条例和限制，因此这些方法可能难以商业化。相比之下，目前通过非转基因方法得到的具有除草剂抗性的植物的环境释放不服从严格的政府条例。因此，本发明的实施例涉及筛选和选择抗除草剂的草坪草植物的方法，包括不通过转基因而有效的方法。

定义

除非另作说明，否则所属相关领域的技术人员应根据常规用途来了解术语。

如本文中所使用，术语“外植体”是指包括分生组织的植物组织。其也可指包括(但不限于)一个或一个以上胚、子叶、下胚轴、叶基、中胚轴、胚芽、原生质体和胚轴的植物组织。

如本文中所使用，术语“愈合组织”是指可生长或维持在培养基中以产生遗传一致细胞的未分化的植物细胞块。

如本文中所使用，术语“抗除草剂”或“除草剂耐受”(包括其任何变化形式)是指植物从与足以引起同一物种的非抗性植物的生长延缓或死亡的量的除草剂接触中恢复、在接触后存活和/或茁壮成长。足以引起非抗性植物的生长或死亡的除草剂的量通常在约2μM到约100μM除草剂浓度的范围内。在一些实施例中，除草剂的足够量在约5μM到约50μM除草剂浓度、约8μM到约30μM除草剂浓度或约10μM到约25μM除草剂浓度的范围内。或者，足以引起非抗性植物的生长或死亡的除草剂的量在每公顷约25克活性成分(g ai ha^-1)到约6500g ai ha^-1除草剂施用的范围内。在一些实施例中，除草剂的足够量在约50g ai ha^-1到约5000g ai ha^-1除草剂施用、约75g ai ha^-1到约2500g ai ha^-1除草剂施用、约100g ai ha^-1到约1500g ai ha^-1除草剂施用、或约250g ai ha^-1到约1000g ai ha^-1除草剂施用的范围内。

如本文中所使用，术语“标记辅助选择”是指通过检测与所需性状有关的一个或一个以上标记来选择植物的所需性状的过程。所述标记可为表型标记，例如除草剂或抗生素抗性。而且，所述标记可为分子标记，例如一种或一种以上多态现象(如下文所述)、DNA或RNA酶、或容易检测的其它序列。

对于个别植物为“外源性”的多核苷酸是通过除有性杂交外的任何方法引入植物中的多核苷酸。下文描述可用来完成的方法的实例，并且包括转化、基因枪法、电穿孔等。所述含有外源性核酸的植物是称作R₀(用于在活体外从转化细胞再生的植物)产生转基因植物。R₀还可指无论是转基因还是非转基因的任何其它再生植物。

如本文中所使用，术语“转基因”描述含有人工改造的基因组的非天然存在的植物，其中所述植物在其基因组中包括外源性核酸分子，所述分子可来源于相同物种或不同物种，包括非植物物种。外源性核酸分子可为基因调控元件，诸如启动子、增强子或其它调控元件，或可含有可与天然或异源基因调控元件有关的编码序列。通过有性杂交或通过自体受精产生的转基因植物是所述植物的子代。

如本文中所使用，“多态现象”意思是在一个或一个以上个体的群体中核酸序列的一个或一个以上基因座存在一个或一个以上变化。所述变化可包含(但不限于)一个或一个以上碱基变化、一个或一个以上核苷酸插入或一个或一个以上核苷酸缺失。多态现象包括单核苷酸多态现象(SNP)、简单序列重复(SSR)、插入缺失(indel)(插入和缺失)、限制片段长度多态现象、单倍体和标记SNP。另外，多态现象可包括遗传标记、基因、DNA衍生序列、RNA衍生序列、启动子、基因的5′未翻译区、基因的3′未翻译区、微小RNA(microRNA)、siRNA、定量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录概况或甲基化模式。多态现象可由核酸复制的随机处理、通过突变诱发、由移动基因组元件、由拷贝数变化和在减数分裂过程期间引起，诸如不等交换、基因组加倍和染色体破坏和融合。变化可常见于群体中或可较低频率地存在于群体中，前者在普通植物育种方面具有较大效用且后者可能与稀少但重要的表型变化相关。

如本文中所使用，“标记”是指多态核酸序列或核酸特征。在更广泛的方面，“标记”可为可用于区别有机体之间的可遗传差异的可检测特征。所述特征的实例可包括遗传标记、蛋白质组成、蛋白质水平、油组成、油水平、碳水化合物组成、碳水化合物水平、脂肪酸组成、脂肪酸水平、氨基酸组成、氨基酸水平、生物聚合物、药物、淀粉组成、淀粉水平、可发酵淀粉、发酵产率、发酵效率、能量产率、次要化合物、代谢物、形态特征和农业学特征。

如本文所使用，“标记分析”指的是一种使用特定方法检测特定基因座的多态性的方法，例如测量至少一种表型(例如种子颜色、花朵颜色或其他可目测的性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、随机扩增多态DNA(RAPD)、基于微阵列的技术和核酸定序技术等。

如本文所使用，“基因型”指的是表型的遗传组成，且此可使用标记物间接表征或通过核酸定序直接表征。适合标记物包括表型特征、代谢特征、遗传标记或一些其他类型的标记物。基因型可构成至少一种遗传标记物基因座的等位基因或至少一种单倍体窗的单倍体。在一些实施例中，基因型可表示单个基因座，且在其他实施例中，可表示全基因组的基因座。在一些实施例中，基因型可以反映部分染色体、整个染色体、部分基因组和整个基因组的序列。

如本文所使用，“数量性状基因座(QTL)”指的是数量上控制到一定程度的基因座，其可表示一般连续分布的形状。

如本文所使用，“核酸序列片段”指的是聚核苷酸的一部分核苷酸序列或多肽的一部分胺基酸序列。核苷酸序列的片段可以编码保留天然或相应全长蛋白质的生物活性的蛋白质片段。核苷酸序列的片段范围为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、约250个核苷酸，且至多基因的全长核苷酸序列或编码本文所揭示蛋白质的序列。

供筛选的适合植物

本发明的实施例针对由除草剂抗性细胞(所述细胞已经历除草剂选择过程)再生的黍亚科(Panicodae)除草剂抗性植物，以及其识别方法。所述植物可以从以下各物的群组中选出：柳叶箬族(Isachneae tribe)、Neurachneae族、Arundinellaeae族和黍族(Paniceae tribe)。在一些实施例中，所述植物可为选自表A或表B中所提供的清单的属的任何成员。适用于本发明的例示性(非详尽)植物清单包括黍族的成员，例如地毯草(Carpetgrass)、马唐草、百喜草、圣奥古斯丁草(St.Augustine grass)和栗(millet)，包括狐尾草(Foxtail)(谷子(Setaria italical))、珍珠粟(Pearl，Pennisetam glaucum)和黍(Proso，Panicum miliaceum；通常称为“常见”黍、高梁黍(broom corn millet)、赤黍(hog millet)或白黍子(white millet)。

在一些实施例中，所述植物为具有商业应用价值的草坪草种类，例如高尔夫球场、田径场、商业绿化、商业或家庭草坪、和牧场。例示性草坪草种类包括(但不限于)海雀稗、百喜草、狗牙根(狗牙根属)、blue gramma grass、野牛草、地毯草(地毯草属)、百足草(假俭草)、克育草(kikuyugrass)、垂穗草(sideoats grama)、圣奥古斯丁草(偏序钝叶草)、结缕草、一年生早熟禾(annual bluegrass)、一年生黑麦草(annual ryegrass)、加拿大早熟禾(Canada bluegrass)、细叶型羊茅(chewings fescue)、细弱翦股颖(colonial bentgrass)、匍匐翦股颖(creeping bentgrass)、冰草(crested wheatgrass)、扁穗冰草(fairway wheatgrass)、硬羊茅(hard fescue)、草地早熟禾(Kentucky bluegrass)、得克萨斯早熟禾、果园草(orchard grass)、黑麦草、红牛毛草(red fescue)、红顶草(redtop)、粗茎苗系草(rough bluegrass)、羊茅(sheep fescue)、无芒雀麦(smooth bromegrass)、高羊茅草、猫尾草(Timothygrass)、绒毛翦股颖(velvet bentgrass)、碱茅(weeping alkaligrass)、纳托尔氏硷茅(western wheatgrass)等。

表A.黍亚科属成员(根据族编组)

族：柳叶箬族	族：Neurachneae	族：Arundmeilleae
			小丽草属(Coelachne)	Neurachne	野古草(Arundinella)
弓果黍属(Cyrtococcum)	Paraneurachne	Chandrasekharania
			异蕊花属(Heteranthoecia)	Thyridolepis	Danthoniopsis
Hubbardia		Diandrostachya
			柳叶箬属(Isachne)		Dilophotriche
Limnopoa		葛氏草属(Garnotia)
			稗荩属(Sphaerocaryum)		巨竹属(Gilgiochloa)
		Isalus
					Jansenella
		Loudetia
					Loudetiopsis
		Trichopteryx.
					三穗苔草(Tristachya)
		结缕草(Zonotriche)

表B.黍亚科的黍族的属成员

在本发明实施例中，待经受本发明方法的植物可以是天然存在的植物、栽培的非转殖基因植物或已通过基因方式修饰的植物，例如转殖基因植物。

愈合组织来源

可以从植物产生可以活体外培养的愈合组织或大量未分化细胞的任何部分采集外植体选择。举例而言，可以从植物的夹层分生组织、未成熟花序或叶片分生组织获得外植体选择。在一些实施例中，可以从植物种子，或其片段或区段获得外植体选择。

在外植体收集之前，可以对源组织或种子进行灭菌步骤，从而避免活体外微生物污染。灭菌可以包括在例如约10v/v％至100v/v％溶液等漂白溶液中冲洗、在例如约50v/v％至95v/v％溶液等纯溶液(例如乙醇溶液)中冲洗、和/或在灭菌去离子水中冲洗。灭菌步骤可以在不会使植物材料致死的任何温度下进行，优选为约20℃至约42℃。

可以使用多种年龄的干燥外植体(在低湿气条件下从种子切下的外植体)或经干燥的湿外植体(在水合/吸入后从种子切下且随后脱水和储存的外植体)。在一些实施例中，外植体相对“年轻”，因为其在使用之前从种子移除不到一天，例如约1至24小时，例如约2、3、5、7、10、12、15、20或23小时。在一些实施例中，视用于保持外植体活力的储存条件而定，外植体可能储存了较长时间，包括数天、数周、数月或甚至数年。所属领域的技术人员可以理解，可以使储存时间最优化，从而可以获得有效愈合组织形成。

在一些实施例中，干燥种子或外植体可以首先例如通过吸入例如水或灭菌液体等液体注液、再干燥且随后用于产生愈合组织。

外植体可以从水合种子、干燥耐储存种子、干燥的水合外植体的部分再水合(其中“水合”和“再水合”定义为种子内部湿气百分比的可测量变化)、或“注液”的种子采出；即种子已开始发芽但已适当放在停滞未决有利条件下来完成发芽过程。所属领域的技术人员将能够使用各种水合方法且使诱发愈合组织之前的培育时间的长度最优化。所得新颖外植体可储存且可发芽和/或用于在提供了适当条件时诱发愈合组织形成。因此，新干燥可储存分生组织外植体可以称作人工种子。

在适当植物培养基中培养外植体选择以促进愈合组织形成。举例来说，植物培养基可为MS/B5培养基(村重(Murashige)和斯库格(Skoog).1962.植物生理学(Physiol Plant)15：473-497；甘博格(Gamborg)等人，1968.实验细胞研究(Exp Cell Res)50：151-158，其各以全文引用的方式并入本文中)，所述培养基补充有植物生长素和包括胺基酸、碳水化合物和盐等养料。已知当适当补充时支持植物组织生长和发育的多种组织培养基，包括由外植体选择形成愈合组织。所述组织培养基可以作为商业制剂购买或由所属领域的技术人员常规制备和改质。所述培养基的实例包括(但不限于)村重和斯库格(1962.植物生理学15：473-497)；楚(Chu)等人(1975.中国科学(Scientia Sinica)18：659-668)；林斯麦尔(Linsmaier)和斯库格(Skoog)(1965.植物生理学(Physiol Plant)18：100-127)；内宫有里(Uchimiya)和村重(Murashige)(1962.植物生理学(Plant Physiol)15：73)；甘博格等人(1968.实验细胞研究50：151-158)；顿坎(Duncan)等人(1985.植物(Planta)165：322-332)；劳埃德(Lloyd)和麦肯(McCown)(1981.ProcAnt Plant Propagator′s Soc 30：421-427)；尼特克(Nitsch)和尼特克(Nitsch)(1969.科学(Science)163：85-87)；以及斯肯克(Schenk)和希尔德布兰德(Hildebrandt)(1972.Can J Bot 50：199-204)所述的培养基；前述文献各自以全文引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员可作相应补充以制造出这些培养基的衍生物所属领域的技术人员了解，用于转型和再生的培养基和例如养料和生长调节剂等培养基补充通常针对特定目标作物或相关变种最优化。组织培养基可以补充有碳水化合物，例如(但不限于)葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、果糖、乳糖、半乳糖和/或右旋糖，或一定比率的碳水化合物。试剂市场有售且可以购自多个供应商(参看例如西格马化工公司(Sigma Chemical Co.)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(Mo.)；和植物科技实验室(PhytoTechnology Laboratory)，肖尼(Shawnee Mission)，堪萨斯州(Kans.))。可以包括其他适合植物生长素，包括(但不限于)麦草畏(dicamba)2，4-二氯苯氧基乙酸(″2，4-D″)等。愈合组织诱发形成可以视外植体选择而定，且可以根据所属领域的技术人员熟知的方案选择和最优化。

愈合组织形成的评估

在出现第一传代培养之前评估各基因型产生愈合组织的能力。可以通过观测每个产生愈合组织的基因型的外植体数目来测定最多产细胞系。在约30天之后，相关数值量表可应用于愈合组织。举例而言，视外植体产生的愈合组织的量而定，数值量表可以由1至5的额定值组成。例示性额定值5可以表示外植体产生大量愈合组织，而额定值1指定为可见愈合组织产量极低的外植体。在定额后，移除每一个愈合组织且传代培养。每一个外植体产生的愈合组织可以识别为个别细胞系。举例来说，可每两周或三周进行每一个愈合组织的传代培养。

对除草剂的剂量反应的评估

通过将每一个待测试基因型的愈合组织放在一系列诱发培养板上来评定用于筛选抗性愈合组织的适当除草剂浓度，所述培养板具有不同浓度的除草剂。剂量反应分析中测试的除草剂浓度范围优选为预测致死剂量的0至15倍，更优选为预测致死剂量的2至10倍，且通常为预测致死剂量的约3至5倍。如剂量反应分析所测定，打算用于筛选抗性愈合组织的除草剂浓度可以比无对照愈合组织生长的最小剂量大30-50％。

除草剂抗性细胞的选择

为了选择除草剂抗性细胞，如剂量反应分析所测定，可以将成熟愈合组织放在含有适当除草剂浓度的愈合组织培养基中。在筛选过程期间，可以将愈合组织传代培养至新鲜培养板中。在识别抗性愈合组织之后，可以将其传代培养至诱发培养基上以供额外生长，这足以支持再生。

除草剂抗性细胞再生成完整植物

自植物培养基移除愈合组织，且接种于适当再生培养基上。已知多种组织培养基在适当补充时支持植物组织生长、发育和再生。所述组织培养基可以作为商业制剂购买或由所属领域的技术人员常规制备和改质。所述培养基的实例包括(但不限于)上文所列出的培养基。作为非限制性实例，可以通过将每一个抗性细胞系的愈合组织放在培养基上再生海雀稗，所述培养基由补充有1.24mg L^-1 CuSO₄和1.125mg/L^-1 BAP(6-苯甲基胺基嘌呤)的MS/B5基础培养基组成。再生培养基可以视植物组织来源、以及所属领域技术人员已知的适当再生培养基的选择和再生方案而定。

再生可在容器中的固体或液体培养基上进行，所述容器例如是皮氏培养皿、烧瓶、槽或任何其它用于培养的合适腔室。容器可视情况被密封(例如用过滤胶带)，以便促进再生植物的气体交换。生长室条件可介于约20℃或更低到40℃或更高之间。在一些实施例中，合适的生长温度可在约22℃到37℃、约25℃到35℃或约28℃到32℃的范围内。黑暗∶光照暴露可在约1小时黑暗∶23小时光照到约12小时黑暗或更长∶12小时光照或更短的范围内。在一些实施例中，黑暗∶光照暴露可在约2小时黑暗∶22小时光照到约10小时黑暗∶14小时光照、约4小时黑暗∶20小时光照到约8小时黑暗∶16小时光照的范围内。黑暗∶光照暴露之后可存在约1小时到10小时黑暗、约2小时到8小时黑暗或约4小时到6小时黑暗中的任一种。在一些实施例中，黑暗期之后可存在其他黑暗周期∶光照暴露之后可存在任何适于再生的组合的黑暗暴露。根据所属领域中熟知的方案选择适当的光强度以促进生长。举例来说，为了促进海雀稗的生长和再生，可对生长中的植物提供大约等于通用(GE)冷白光灯泡在66-95μE m^-2 s^-1的强度下提供的光强度。

再生植物的子代

再生植物可无性繁殖。举例来说，再生植物可自我授粉。在一些实施例中，花粉可从再生植物获得，且与具有第二种所要特性的另一种植物的种子生长植物杂交。在一些实施例中，花粉可从具有第二种所要特性的植物获得且用于对再生植物授粉。再生植物的子代可例如是种子或繁殖扦插物，其中再生植物的除草剂抗性是从亲本遗传得到。此外，再生植物可自我杂交或近亲杂交以产生抗性等位基因的纯合植物品系。在一些情况下，所述纯合植物可具有比初始选择的杂合植物高的抗性水平。

营养繁殖可通过使用草皮、楔形枝、小枝和匍匐茎实现。当用于草坪草品种时，所述草的营养繁殖产生的子代通常是纯系的(遗传上相同)。纯系营养品种产生外观非常均一的草皮。

某些品种仅由营养方法繁殖；具有这种特征的例示性品种包括观赏植物、小果和树。

除草剂抗性的分子表征

植物中导致除草剂抗性的突变可通过从植物组织提取DNA和随后进行PCR扩增来表征。植物DNA可经由许多DNA提取方法提取，例如CTAB方法(莱斯纳(Lassner)等人，1989.植物分子生物学报道(Plant Mol.Biol.Rep.)7：116-128，其以全文引用的方式并入本文中)、SDS-乙酸钾方法(得拉波塔(Deilaporta)等人1983.植物分子生物学报道(Plant Molecular Biology Reporter)1：19-21，其以全文引用的方式并入本文中)、叶组织的直接扩增(波托姆(Berthomieu)和梅耶(Meyer)1991.植物分子生物学(Plant Molecular Biology)17：555-557，其以全文引用的方式并入本文中)、烧沸方法(伊可达(Ikeda)等人2001.植物分子生物学报道(Plant Molecular Biology Reporter)19(1)：27-32，其以全文引用的方式并入本文中)、碱性处理方法(辛(Xin)等人2003.生物技术(BioTechniques)34：820-826，其以全文引用的方式并入本文中)、FTA

卡片或任何其它有效的用于植物的DNA提取方法。用于启动赋予除草剂抗性的DNA区域的PCR扩增的引物可被设计成匹配最大数量的可能相关物种的保守侧接序列。

鉴别与乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性相关的突变

可评估通过本文揭示的方法鉴别为对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂具有抗性的植物的乙酰辅酶A羧化酶基因内的基因突变。举例来说，在一些实施例中，基因突变可导致乙酰辅酶A羧化酶蛋白在残基Gin 1756、He 1781、Trp 1999、Trp 2027、lie 2041、Asp 2078、Cys 2088和/或Gly 2096上的突变。在一些实施例中，那些残基上的突变可包括(但不限于)亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，乙酰辅酶A羧化酶蛋白内的氨基酸取代可例如是Gin 1756取代为Glu、He 1781取代为Leu、He 1781取代为Ala、He 1781取代为Val、Trp 1999取代为Cys、Trp 2027取代为Cys、He 2041取代为Asp、He 2041取代为Val、Asp 2078取代为Gly、Asp 2078取代为Val、Cys 2088取代为Arg和/或Gly 2096取代为Ala等。在一些实施例中，氨基酸取代可为例如上文所述位置的位置上的两个或两个以上突变的组合，涉及上文所述位置的改变。同样地，在一些实施例中，可在这些位置和/或所属领域技术人员已知可作为乙酰辅酶A羧化酶与乙酰辅酶A羧化酶抑制剂之间的接触或相互作用的位置的其它位置上进行其它保守取代。

导致ACC蛋白中氨基酸取代的乙酰辅酶A羧化酶基因中的突变包括表C中所列的突变。

表C.与乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性有关的氨基酸取代的总结

此外，乙酰辅酶A羧化酶除草剂抗性可通过任何所述氨基酸位置上的任何保守取代赋予。表D提供保守取代的列表。

表D.保守氨基酸取代

第1组	He，Leu，Val，Ala，Gly
		第2组	Trp，Tyr，Phe
第3组	Asp，Glu，Asn，Gin
		第4组	Cys，Ser，Thr，Met

第5组	Pro
		第6组	His，Lys，Arg

评估对除草剂的总体植物抗性

可通过比较除草剂抗性细胞系与除草剂敏感对照株的除草剂暴露效果来评估总体植物除草剂抗性。除草剂暴露可通过用各种施用量(在相关物种的已知致命剂量的0到20倍的范围内)的除草剂处理除草剂抗性植物和除草剂敏感对照株来实现。

除草剂抗性

本发明实施例涉及本文所揭示的在用于在商业应用的植物中产生除草剂抗性的方法和组合物。在本发明的实施例中，选择且鉴别抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物。

已知乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)以两种形式存在：真核和原核形式。原核形式由四个亚单位构成，而真核形式为具有独特功能域的单个多肽(哈伍德(Harwood)等人1988.植物分子生物学(Plant Molecular Biology)39：101-138，其以全文引用的方式并入本文中)。乙酰辅酶A在脂质生物合成的第一个关键步骤中被乙酰辅酶A羧化酶羧化形成丙二酰辅酶A。在大多数植物中，乙酰辅酶A羧化酶划分为两种形式(佐佐木(Sasaki)等人1995.植物生理学(Plant Physiology)108：445-449，其以全文引用的方式并入本文中)。已知叶绿体为脂质合成的主要场所；但乙酰辅酶A羧化酶也可存在于细胞溶质中。大多数植物在叶绿体中具有原核形式，且在细胞溶质中具有真核形式。四聚原核蛋白由四个独特基因编码，一个位于叶绿体基因组中。真核形式由大小为约12,000bp的核基因编码(波德文斯基(Podkowinski)等人1996.美国科学院院报(PNAS)93：1870-1874，其以全文引用的方式并入本文中)。草的独特性在于在细胞溶质与叶绿体中均可见真核形式的乙酰辅酶A羧化酶(前述佐佐木(Sasaki)等人1995)。在草的质体和细胞溶质中，真核形式的乙酰辅酶A羧化酶很类似，编码其之基因也很类似(刚尼奇(Gornicki)等人1994.美国科学院院报(PNAS)91：6860-6864，其以全文引用的方式并入本文中)。然而，尽管质体和细胞溶质中真核形式的乙酰辅酶A羧化酶之间具有同源性，但细胞溶质形式不受抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂影响(德尔叶(Delye)2005.植物生理学(Plant Physiology)137：794-806，其以全文引用的方式并入本文中)。

充当乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂的除草剂可阻断植物的脂质生物合成，从而造成活性生长区(诸如分生组织)的膜被破坏。乙酰辅酶A羧化酶抑制剂例如丙酸芳氧基苯氧酯(APP)化学家族(也称作FOP)和环己二酮(CHD)家族(也称作DIM)。

因此，本发明实施例涉及选用于抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的植物和其鉴别方法。在一些实施例中，植物抗环己二酮除草剂、丙酸芳氧基苯氧酯除草剂、苯基吡唑啉除草剂或其混合物。在一些实施例中，植物对至少一种选自表E中所提供的清单的除草剂具有抗性。

表E.乙酰辅酶A羧化酶抑制剂

Fusion w/Fluazifop

除草用环己二酮包括(但不限于)稀禾定(2-[1-(乙氧基亚氨基)-丁基]-5-[2-(乙硫基)丙基]-3-羟基-2-环己烯-1-酮，以名称POAST^TM购自巴斯夫公司(BASF)(新泽西州帕斯攀尼(Parsippany，N.J.)))、克草同((E，E)-(±)-2-[1-[[(3-氯-2-丙烯基)氧基]亚氨基]丙基]-5-[2-(乙硫基)丙基]-3-羟基-2-环己烯-1-酮；以SELECT^TM购自雪佛龙化学公司(住友)(Chevron Chemical(Valent))(加利福尼亚州弗雷斯诺(Fresno，Calif.)))、氯丙氧定((E，E)-2-[1-[[(3-氯-2-丙烯基)氧基]亚氨基]丁基]-5-[2-(乙硫基)丙基]-3-羟基-2-环己烯-1-酮；以SELECTONE^TM购自雪佛龙化学公司(住友)(Chevron Chemical(Valent))(加利福尼亚州弗雷斯诺(Fresno，Calif.)))和苯草酮(2-[1-(乙氧基亚氨基)丙基]-3-羟基-5-均三甲苯基环己烯-2-烯酮，以GRASP^TM购自美国陶氏化学公司(Dow Chemical USA)(密歇根州米德兰(Midland，Mich.)))。另外，除草用环己二酮包括(但不限于)环苯草酮、环杀草和得杀草。

除草用丙酸芳氧基苯氧酯和/或芳氧基苯氧基丙酸展现针对植物的一般和选择性除草活性。在这些化合物中，芳氧基可为苯氧基、吡啶基氧基或喹喏啉基。除草用丙酸芳氧基苯氧酯包括(但不限于)合氯氟((2-[4-[[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氧基]苯氧基]-丙酸)，其以VERDICT^TM购自美国陶氏化学公司(Dow Chemical U.S.A.)(密歇根州米德兰(Midland.Mich.)))、禾草灵(((+)-2-[4-(2，4-二氯苯氧基)-苯氧基]丙酸)，以HOELON^TM购自赫司特劳塞尔公司(Hoechst-Roussel Agri-Vet Company)(新泽西州萨默维尔(Somerville，N.J.)))、恶唑禾草灵((±)-2-[4-[(6-氯-2-苯并恶唑基)氧基]苯氧基]丙酸；以WHIP^TM购自赫司特劳塞尔公司(Hoechst-Roussel Agri-Vet Company)(新泽西州萨默维尔(Somerville，N.J.)))、吡氟禾草灵((±)-2-[4-[[5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氧基]苯氧基)丙酸；以FUSILADE^TM购自ICI美洲公司(ICI Americas)(特拉华州威尔明顿(Wilmington，Del.)))、精吡氟禾草灵((R)-2-[4-[[5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氧基]苯氧基]丙酸；以FUSILADE 2000^TM购自ICI美洲公司(ICI Americas)(特拉华州威尔明顿(Wilmington，Del.)))、快伏草((±)-2-[4[(6-氯-2-喹喏啉基)-氧基]苯氧基]丙酸；以ASSURE^TM购自杜邦公司(E.I.DuPont de Nemours)(特拉华州威尔明顿(Wilmington，Del.)))和炔草酸。

除草用环己二酮或除草用丙酸芳氧基苯氧酯或除草用苯基吡唑啉的类似物

乙酰辅酶A羧化酶抑制剂中包括结构上与本文所揭示的除草用环己二酮、除草用丙酸芳氧基苯氧酯或除草用苯基吡唑啉有关的除草剂，诸如类似物、代谢物、中间物、前驱物、盐等。

用相关基因转化

在本文所揭示的方法中，分离特定DNA片段且克隆到载体中以供转化植物组织或细胞。举例来说，从A细胞系(实例)的乙酰辅酶A羧化酶基因分离384个碱基对片段，其中已鉴别到在乙酰辅酶A羧化酶蛋白的位置1781处异亮胺酸突变为亮胺酸(“Ile1781Leu”或“I1781L”)。鉴别的所述片段可用于转化本文所揭示的植物组织和细胞。

已开发各种方法将基因转移到植物组织中，包括(但不限于)高速显微喷射、显微注射、电穿孔、直接DNA吸收和细菌介导的转化。已知介导植物细胞转化的细菌包括根瘤菌科(Rhizobiaceae)的多个种，包括(但不限于)土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)(例如布鲁斯阿茨(Broothaerts)等人，2005.自然(Nature)433：629-633和美国专利申请公开案2007/0271627，其各自以全文引用的方式并入本文中)。所述转化的标靶可为未分化的愈合组织、已分化组织、源自特定细胞系的细胞群体等。共培养和后续步骤可在约23℃或低于25℃的温度下，且可在高达约35℃或40℃或高于40℃下，在黑暗条件下或在光(例如光亮的Percival培育箱)下执行2到5天(例如，光期为16小时光/8小时黑暗，光强度≥5μE，诸如约5-200μE或允许正常质体发育的其他照明条件)。

含有经分离DNA片段的载体可含有多个有利于转化植物细胞或组织且调节结构核酸序列表达的遗传组分。

在一些实施例中，载体可含有可选择、可筛选或可评分的标记基因。在本文中这些遗传组分也称作功能遗传组分，因为其产生提供鉴别已转化植物的功能的产物或具有农学效用的产物。充当选择或筛选手段的DNA可在可再生植物组织中用于产生以下化合物，其将赋予植物组织对化合物的抗性，否则所述化合物对植物组织有毒。多个可筛选或可选择标记基因在所述领域中已知且可用于本发明。适用作标记的相关基因包括(但不限于)GUS、绿色萤光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUX)等。已知其他示范性标记且包括β-葡糖醛酸酶(GUS)，其编码各种发色底物的酶(杰佛森(Jefferson)等人1987.生物化学学会学报(Biochem Soc Trans)15：7-19；杰佛森(Jefferson)等人1987.欧洲分子生物学学会报告(EMBO J)6：3901-3907，其各自以全文引用的方式并入本文中)；R-基因座基因，其编码调节植物组织中花青甙色素(红色)产生的产物(德尔波特(Dellaporta)等人1988.染色体结构与功能：新概念的影响(Chromosome Structure and Function：Impact of New Concepts).第18届斯塔德勒遗传学研讨会(18^th Stadler Genetics Symposium)11：283-282，其以全文引用的方式并入本文中)；β-内酰胺酶基因(萨克里菲(Sutcliffe)等人1978.美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)75：3737-3741，其以全文引用的方式并入本文中)；已知编码各种发色底物的酶的基因(例如PADAC，发色头孢菌素(cephalosporin))；萤光素酶基因(欧文(Ow)等人1986.科学(Science)234：856-859，其以全文引用的方式并入本文中)；编码可转化发色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶的xylE基因(左瓦斯基(Zukowsky)等人1983.美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)80：1101-1105，其以全文引用的方式并入本文中)；α-淀粉酶基因(伊卡图(Ikatu)等人1990.生物技术(Bio/Technol)8：241-242，其以全文引用的方式并入本文中)；酪胺酸酶基因(卡茨(Katz)等人1983.普通与应用微生物学杂志(J Gen Microbiol)129：2703-2714，其以全文引用的方式并入本文中)，其编码能够将酪胺酸氧化成DOPA与多巴醌的酶，DOPA和多巴醌又缩合成黑色素；绿色萤光蛋白(艾利欧(Elliot)等人1999.植物细胞报告(Plant Cell Rep)18：707-714，其以全文引用的方式并入本文中)和α半乳糖苷酶。如所属领域中所熟知，可使用植物转化的其他方法，例如米其(Miki)等人(1993.植物分子生物学与生物技术中的方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)，格里克(Glick)与汤普森(Thompson)(编)，CRC出版社(CRC Press)，公司(Inc.)：波卡若顿(Boca Raton)，第67-88页，其以全文引用的方式并入本文中)所述，包括使用微粒轰击(例如美国专利第5,914,451号；麦卡比(McCabe)等人1991.生物/技术(Bio/Technology)11：596-598；美国专利第5,015,580号；美国专利第5,550,318号；和美国专利第5,538,880号；前述各文献以全文引用的方式并入本文中)。

转基因植物可通过所述领域中已知的方法和组合物从已转化植物细胞再生。举例来说，使用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物通常含有插入一个染色体中的单个简单重组DNA序列，且称作转基因事件。所述转基因植物可称作杂合有所插入的外源序列。对于一种转基因的转基因植物纯合子可通过含有单个外源基因序列的独立分离的转基因植物与自身(例如R_o植物)有性配对(自身受精)产生R₁种子而获得。所产生的1/4的R₁种子纯合有这个转基因。R₁种子发芽得到可测试接合性的植物，通常使用可区别杂合子与纯合子的SNP测定或热扩增测定(亦即接合性测定)。或者，可从数个R₁植物产生R₂子代且对其进行测试，其中所有个体均具有抗性的均质R₂子代表示纯合R₁亲本。

为证实转基因植物中外源DNA或“转基因”的存在，可执行多种测定。所述测定包括例如“分子生物”测定，诸如南方墨点法(Southern blotting)和北方墨点法(northern blotting)以及PCR、INVADER^TM测定；“生物化学”测定，诸如侦测蛋白产物的存在，例如通过免疫方法(ELISA和西方墨点法(western blot))或通过酶促功能；植物部分测定，诸如叶子或根测定；以及通过分析完整再生植物的表型。

针对一种突变进行选择且在植物中证实之后，或将转基因引入植物中之后，突变或转基因可引入与第一个植物通过杂交有性相容的任何植物中，而无需在第二个植物中直接选择突变体或转化第二个植物。因此，如本文所用之术语“子代”可表示源自本发明制备的亲本植物的任一代子代，其中子代包含所要基因型或表型，无论是转基因或非转基因。视习知用法和/或常规定义而定，“转基因植物”因此可具有任何代。对植物进行“杂交”而提供相对于起始植物细胞系具有一或多个所选突变、表型和/或添加的转基因或等位基因的植物细胞系可通过将起始或基础植物与包含突变等位基因、转基因等的供体植物细胞系杂交而将特定序列引入植物细胞系中。为达成这个目的，克例如执行以下步骤：(a)种植第一(起始细胞系)和第二(包含所要转基因或等位基因的供体植物细胞系)亲本植物的种子；(b)使第一和第二亲本植物的种子生长成具有花的植物；(c)用第二亲本植物的花粉对第一亲本植物的花授粉；和(d)收集具有已受精花的亲本植物上产生的种子。

控制杂草和使抗除草剂植物选择性生长的方法

去除不适宜杂草可通过用除草剂处理需要排他性生长抗性植物种的区域来完成，其中已对这些除草剂具有抗性。因此，本发明实施例涉及在通过本文所揭示方法鉴别的除草剂抗性植物附近控制杂草的方法，包括：使至少一种除草剂与杂草和除草剂抗性植物接触，其中至少一种除草剂用足以抑制相同物种的非选择植物和/或需要抑制的杂草种的生长或使其死亡的速率接触杂草和植物。非选择植物通常对除草剂无抗性。

在一些实施例中，除草剂可直接与抗除草剂植物和杂草接触。举例来说，除草剂可直接在抗除草剂植物和杂草上撒播。或者，除草剂可直接在抗除草剂植物和杂草上喷洒。可将除草剂施用于抗除草剂植物和杂草的其他方法包括(但不限于)撒播或喷洒在含有抗除草剂植物和杂草的区域或地块上。

在一些实施例中，可使除草剂接触抗除草剂植物和杂草所处的生长培养基或添加到这个生长培养基中。生长培养基可为(但不限于)土壤、泥煤、污泥、泥浆或砂子。在其他实施例中，除草剂可包括在灌溉植物的水中。

通常，足以使非抗性植物或非选择植物生长或死亡的除草剂的量介于约2μM或2μM以下到约100μM或100μM以上的除草剂浓度。在一些实施例中，足量除草剂介于约5μM到约50μM除草剂浓度，约8μM到约30μM除草剂浓度，或约10μM到约25μM除草剂浓度。或者，足以使非抗性植物生长或死亡的除草剂的量介于每公顷约25公克活性成分(g ai ha^-1)到约6500g ai ha^-1除草剂施用。在一些实施例中，足量除草剂介于约50g ai ha^-1到约5000g ai ha^-1除草剂施用，约75g ai ha^-1到约2500g ai ha^-1除草剂施用，约100g ai ha^-1到约1500g ai ha^-1除草剂施用，或约250g ai ha^-1到约1000g ai ha^-1除草剂施用。

标记物辅助的选择方法

标记物辅助的选择(MAS)也称为分子育种或标记物辅助的育种(MAB)，是指通过检测植物中的一种或一种以上标记物来选择植物中所需性状的方法，其中标记物与所需性状有关联。在一些实施例中，用于MAS的标记物为分子标记物。在其它实施例中，标记物为如上所讨论的表型标记物。

在分子育种计划中，可使用遗传标记物等位基因来鉴别在一个标记物基因座、一些基因座或单倍型上含有所需基因型，因此预计将所需基因型连同相关所需表型一起传给子代的植物。标记物可用于植物育种中，这是因为一旦这些标记物建立，其将不受环境或上位相互作用的影响。此外，某些类型的标记物适合于高通量检测，能够以成本有效的方式迅速地鉴别。

由于分子标记物中存在等位基因的差异，所以可以通过统计学评价分离群体的基因型和表型来鉴别数量性状基因座(quantitative trait loci，QTL)。定位QTL的方法为所属领域中所熟知，并描述于例如WO 90/04651；美国专利第5,492,547号、美国专利第5,981,832号、美国专利第6,455,758号；菲林·加西亚(Flint-Garcia)等人，2003植物生物学年鉴(Ann.Rev.Plant Biol.)54：357-374中，前述各参考文献以全文引用的方式并入本文中。在这些情况下，通过代替用基因分型进行高成本、时间密集的表型分析，使用标记物推断表型可使育种计划更为经济。标记物方法允许在植物成熟之前选择，由此节省时间且有效地利用土地。也可以在种子水平上进行选择，以便种植优选种子(美国专利公开案第2005/000213435号和美国专利公开案第2007/000680611号，前述各案以全文引用的方式并入本文中)。另外，育种计划可以设计成通过靶向特定基因型，明确地推动具体、有利的表型的频率(美国专利第6,399,855号，以全文引用的方式并入本文中)。可以连续地监测这些群落的准确度，以确保维持预测能力，从而告知培育决定(美国专利申请案2005/0015827，以全文引用的方式并入本文中)。

因此，本发明的实施例涉及标记物辅助的育种方法，这些方法包括：鉴别用于育种和选择的相关特征，其中此特征与乙酰辅酶A羧化酶基因有关联；提供携带能够赋予植物乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性的乙酰辅酶A羧化酶序列变异体的第一植物，其中此植物另外包含此相关特征；将第一植物与第二植物一起培育；鉴别培育步骤中具有此乙酰辅酶A羧化酶序列变异体的子代；和基于鉴别步骤，选择可能具有此相关特征的子代。相关特征可以为选自以下群组的任一者或多者：除草剂耐性、抗病性、抗虫性、脂肪酸、蛋白质或碳水化合物代谢改变、生长速度提高、胁迫耐性增强、优选成熟、感官性质增强、地貌特征改变、无菌、其它农业性状、工业用途的性状或提高消费者吸引力的性状。

在一些实施例中，可基于核酸来分析遗传多态现象是否存在，从而用于选择繁殖种群中的种子或植物。分析可用于选择包含遗传标记物或与其相联的基因、QTL、等位基因或基因组区域(单倍型)。举例来说，标记物可以为包括对应于乙酰辅酶A羧化酶蛋白质中选自以下群组的至少一个氨基酸位置的变异的乙酰辅酶A羧化酶序列变异体：Gin 1756、Ile 1781、Trp 1999、Trp 2027、Ile 2041、Asp 2078、Cys 2088和Gly 2096。在一些实施例中，变异可以为选自以下群组的至少一者：Gln1756Glu、Ile1781Leu、Ile1781Ala、Ile1781Val、Trp1999Cys、Trp2027Cys、Ile2041Asp、Ile2041Val、Asp2078Gly、Asp2078Val、Cys2088Arg和Gly2096Ala。核酸分析方法为所属领域中所知，且包括(但不限于)基于PCR的检测方法(举例来说TaqMan分析)、微阵列方法和核酸定序法。在一些实施例中，通过使用核酸扩增方法，简化DNA、RNA或cDNA的样品中多态现象部位的检测。这些方法特别提高覆盖多态现象部位，或包括此部位和远离或靠近此部位的序列的聚核苷酸的浓度。这些扩增的分子可易于通过凝胶电泳、荧光检测方法或其它方式检测。因此，扩增分析、这些分析中所用的寡核苷酸和通过这些分析产生的相应核酸产物也可用于标记物辅助的育种计划中以通过选择育种来选择具有所需性状的子代。

同样，可基于仅仅表型分析，进行基于乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性的MAS。开始培育植物并选择，或工程改造，使得相关性状与赋予乙酰辅酶A羧化酶抑制剂抗性的等位基因非随机相关(关联)。接着此植物可与具有其它所需性状的植物杂交。推测显示乙酰辅酶A羧化酶抑制剂抗性的植物也携带与抗性标记物关联的性状。关联越紧密/越高，推测越肯定。因此，乙酰辅酶A羧化酶抑制剂抗性等位基因通过产生例如经受住另外致死量的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的植物，可用作MAS的表型标记物，或者由于简化与抗性等位基因相关联的序列变异体的检测而可以用作分子标记物。举例来说，可以分析与乙酰辅酶A羧化酶序列差异相关联的除草剂抗性。除草剂抗性性状可包括对选自以下群组的任一种或多种除草剂的抗性：禾草灭、丁苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、精恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。可如本文中所述，评估通过应用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂和观测对除草剂的抗性进行选择的方法。

MAS方案在所属领域中众所周知，且使用各种标记作为工具。举例来说，MAS在美国专利第5,437,697号、美国专利公开案第2005/000204780号、美国专利公开案第2005/000216545号、美国专利公开案第2005/000218305号、美国专利公开案第2006000504538号、美国专利第6,100,030号和麦克尔(Mackill)(2008.生物科学(Phil Trans R Soc B)363：557-572)中有所描述，上述各者以引用的方式并入本文中。因此，所属领域的技术人员可在MAS方案中使用本发明的抗性表型或序列作为工具来选择与乙酰辅酶A羧化酶抑制剂抗性等位基因相关的性状。

已详细描述本发明，明显的是，在不背离随附权利要求中所定义的本发明范畴下，修改、变化和等效实施例为可能的。此外，应了解，以非限制性实例形式提供本发明中的所有实例。

实例

提供下列非限制性实例以进一步说明本文所公开的本发明实施例所属领域的技术人员应了解随后实例中所公开的技术代表已发现可在实践本发明实施例中发挥良好功用的途径，且因此可被认为构成本发明实践模式的实例。然而，所属领域的技术人员根据本发明应了解，可在不背离本发明的精神和范畴下，在所公开的特定实施例中作出多种变化，且仍获得相同或相似的结果。

实例1

从植物的居间分生组织中获得的愈合组织产生

在图18中说明例示性外植体选择。外植体组织可从含有最上部三片叶片的嫩枝中获得。在低于最低叶节点处切割嫩枝，而且可修整各叶片顶部以在杀菌程序期间保持间距。将切片放到漂白剂溶液(20％体积/体积)大约10分钟，随后在70％乙醇中放置10分钟，之后用无菌水冲洗。去除外侧(较成熟)两片叶片，在茎上留下最新的叶片。将新叶片在20％漂白剂中杀菌1分钟，在70％乙醇中杀菌1分钟，且随后在无菌水中冲洗。所述叶片靠近节点的底部为居间分生组织。移除此切片下部5毫米，且将其种植于愈合组织诱导培养基上，所述培养基含有MS基本盐(村重(Murashige)和斯科格(Skoog).1962.植物生理学(Physiol Plant)15：473-497，其以全文引用的方式并入本文中)，补充有B5维生素(甘博格(Gamborg)等人，1968.实验细胞研究(Exp Cell Res)，50：151-158，其以全文引用的方式并入本文中)、2，4-二氯苯氧乙酸(“2，4-D”)、蔗糖，且调节至pH8.5。将所种植的外植体在27℃的温度下放到暗处。

表1.愈合组织诱导培养基

实例2

从未成熟雀稗属花簇中获得的愈合组织产生

在花序伸出之前自温室生长的植物获得未成熟花簇，且将其用作产生愈合组织的外植体组织来源。分离两穗花簇，且用含几滴吐温80(Tween 80)的10％(体积/体积)漂白剂表面杀菌10分钟，且用无菌水冲洗，之后将其种植于MS培养基上，所述培养基含B5维生素(村重(Murashige)和斯科格(Skoog).1962.同上文；甘博格(Gamborg)等人，1968.同上文)和2毫克/升2-4，D。获得10种基因型的外植体组织，包括来自格鲁吉亚大学海滨雀稗属育种计划(University of Georgia Seashore Paspalum Breeding Program)的8种实验细胞系、一种所采集的生态型(莫纳克亚(Mauna Kea)(PI 647892))和商业种植的品种“浪花(Seaspray)”。将四种外植体种植于各培养板上，且用耐斯克膜(Nescofilm^TM)(卡兰研究产品公司(Karlan Research Products Co)；科顿伍德(Cottonwood)，AZ)密封培养板。将外植体在27℃下放到暗处。自这些10种基因型之间产生总共21个细胞系(表2)。基于基因型和将外植体组织放到诱导培养基上的日期，给与所产生的各愈合组织以细胞系名称。

表2.海滨雀稗属的活体外愈合组织产生和选择赋予稀禾定抗性的突变的总结

实例3

雀稗属对除草剂的剂量-反应曲线

使用由作为模型栽培品种的品种『浪花』产生的愈合组织测定培养中雀稗属组织对稀禾定施用量的剂量反应。通过将来自『浪花』的愈合组织放放到含有2毫克/升2-4，D和8种浓度中1种浓度的稀禾定的MS/B5培养基(村重(Murashige)和斯科格(Skoog).1962.同上文；甘博格(Gamborg)等人，1968.同上文)上来确定稀禾定浓度对愈合组织生长的作用。除草剂施用量重复测定6次且包括0μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM、25μM、50μM及100μM稀禾定的浓度。在甲醇中稀释稀禾定，且在高压蒸汽处理的培养基冷却到大约55℃后添加(以防止由于热降解而丧失活性)。通过在存储前将容器包裹于铝箔中来保护培养基以免光降解。

为测量愈合组织生长，称出0.5克愈合组织，分成9等块且以3×3图案放到各培养板的固体培养基上。以完全随机设计将八种稀禾定浓度中各浓度6块重复培养板分布于生长室中的支架上。种植后第21天，称量各培养板组织的重量且记录。为传代培养，自各培养板获得0.5克以进入下一生长期。此过程持续9周，各培养板得到三个生长测量结果。用各培养板在各测量点(第3周、第6周和第9周)时的重量除以初始重量，获得质量比较增加量。使用三个连续传代培养物平均的针对各除草剂施用量的愈合组织生长来辨别适用于选择突变体的浓度。使用非线性回归将愈合组织回应于稀禾定浓度的生长与负指数式衰减函数拟合(美国SAS软件研究所(SAS Institute，Inc.)2008.SAS OnlineDoc

9.2.凯利(Cary)，NC)。完全抑制愈合组织生长的最低除草剂施用量为7.5μM稀禾定。为确保功效，选择1.0μM稀禾定浓度来选择抗性细胞(图3)。

实例4

选择稀禾定抗性细胞系

通过将约6个月大的愈合组织放到含有10μM稀禾定的愈合组织诱导培养基(实例1)上来对稀禾定抗性(SR)细胞进行选择。使用大培养板(尺寸为245×245mm)来高效地筛选较多数量的细胞。将直径为约4mm的愈合组织放到15×15的格子中，每块培养板得到总共225个愈合组织。以3周的时间间隔传代培养愈合组织三次(实例3)，选择期总共9周。在容纳补充有10μM稀禾定的愈合组织诱导培养基(实例1)的100×15mm皮氏培养皿(petri dish)中传代培养抗性愈合组织1个月，以获得足够的愈合组织。此操作提供12周或12周以上的总选择时间。

总共筛选20,250个愈合组织。选择过程产生65个稀禾定抗性(SR)细胞系，表示突变率为每312个愈合组织中有一个抗性品系。产生SR愈合组织的6个细胞系为莫纳克亚、GA05-025-164、UGA03.539.13、UGA05.025.181、UGA03.525.22和UGA03.09E-3。在所有基因型中SR愈合组织的出现率低，且处于0到0.0051的范围内。虽然对于所有基因型来说，回收SR细胞系的概率低，但所回收的SR细胞系的数目不同且处于零到高达每培养板225个愈合组织9个SR细胞系的范围内。对获得抗性愈合组织品系的概率差异的统计分析指示基因型间无显着差异(p＝0.35)。给与抗性愈伤组织以SR名称，自选择培养基中移出，且传代培养以在再生前使组织增加。

实例5

稀禾定抗性细胞系再生

试图使所有抗性愈合组织再生。所用的再生培养基为MS/B5培养基(村重(Murashige)和斯科格(Skoog).1962.同上文；甘博格(Gamborg)等人，1968.同上文)，其补充有1.24mg/L CuSO₄和1.125mg/L 6-苯甲基氨基嘌呤(BAP)(阿尔皮特(Altpeter)等人，2005.国际草坪草社会研究期刊(International Turfgrass Society Research Journal)，10：485-489，其以全文引用的方式并入本文中)。将各稀禾定抗性(SR)细胞系的愈合组织放到五块培养板上的4×4格子中，各愈伤组织的尺寸为约4mm的直径。接着将培养板放到生长室中，所述生长室保持25℃及1小时黑夜∶23小时白天的光周期，其中由冷光型日光灯提供66-95μmol光子m^-2S^-1的光强度。在30天时间结束时，针对再生评价所有培养板。如果嫩枝出现，就在再生培养基上再传代培养细胞系1个月。

在嫩枝发育后，通过在无生长调节剂下将组织放到MSO培养基(列于下表3中)诱导生根。当根生长充分(约30天)时，自培养基移出植物，且直接放到花盆中，所述花盆容纳Fafard

3B(亚加瓦姆镇(Agawam)，马萨诸塞州(MS))混合物与砂的1∶1混合物。接着将盆栽植物转移到温室中，温室中保持24℃到32℃10小时白天14小时黑夜的光周期。

表3.诱导生根的MSO培养基

65个SR细胞系中的2个SR细胞系在再生前死亡，因此剩余63个SR细胞系，使三个细胞系再生：A细胞系、B细胞系和C细胞系。A细胞系和B细胞系源自相同细胞系，所述细胞系来源于2008年1月12日产生的莫纳克亚，而C细胞系源自2008年3月4日产生的实验细胞系UGA03-098E-3。再生的三种细胞系的愈合组织为致密的且为黄色，而相比来说，大部分细胞系的愈合组织为白色且柔软的。

实例6

稀禾定抗性细胞系的分子表征

一旦选择SR雀稗属细胞系，就对引起抗性的突变进行表征。使用CTAB方法(兰瑟(Lassner)等人，1989.植物分子生物学报道(Plant Mol Biol Report)，7：116-128，其以全文引用的方式并入本文中)从再生植物的愈合组织或叶片组织中提取出DNA。使用乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)胺基酸序列(迪徕(Délye)等人，2005.杂草研究(Weed Research)，45：323-330，其以全文引用的方式并入本文中)来确定物种间的同源区域。使用狗尾草(Setaria viridis)乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸序列(基因库AF294805)(迪徕(Délye)等人，2002，植物(Planta)，214：421-427，其以全文引用的方式并入本文中)来设计扩增海滨雀稗属的同源区域的引物，且改变个别碱基以匹配由基因库的BLAST功能所测定可能的最多数目的草物种。所得引物扩增乙酰辅酶A羧化酶基因的384个碱基对片段，所述片段跨越引起1781位置上Ile向Leu取代的A向T转换。引物命名为SV384F(5′CGGGGTTCAGTACATTTAT 3′，SEQ ID NO：1)和SV348R(5′GATCTTAGGACCACCCAACTG 3′，SEQ ID NO：2)。退火温度为53℃，延长时间为30秒和35个循环。所研发的对乙酰辅酶A羧化酶基因的2078位置进行定序的引物命名为SVAC2F(5′AATTCCTGTTGGTGTCATAGCTGTGGAG 3′，SEQ ID NO：3)和SVAC1R(5′TTCAGATTTATCAACTCTGGGTCAAGCC 3′，SEQ ID NO：4)，且用于扩增此片段的PCR条件与用于扩增1781的条件相同。SVAC引物扩增跨越乙酰辅酶A羧化酶基因中位置2078的编码区域的520bp片段。

实例7

识别稀禾定抗性细胞系且自细胞系再生稀禾定抗性雀稗属

表2总结迄今为止的选择过程，迄今为止，已产生65个稀禾定抗性细胞系。抗性愈合组织形成的频率为每312个进行完全选择过程的愈合组织1个抗性愈合组织。可再生的稀禾定抗性(SR)愈合组织的出现率为每32.5个抗性愈合组织1个可再生稀禾定抗性愈合组织。再生的SR细胞系的出现率为每10,125个通过选择过程的愈合组织1个SR细胞系。

单愈合组织细胞的平均体积测量为1.3582×10^-5μL。此提供每4mm直径的愈合组织块258,000个细胞的近似值。因此，通过选择的20,250个愈合组织含有约52亿个细胞。假定仅单个突变细胞为各SR细胞系的成因，则抗性细胞在本实验中的出现率为每8×10⁷个细胞1个抗性细胞。在1781aa位置上获得A向T突变的出现率为1.74×10⁹分之一。

迄今为止，四个SR愈合组织(细胞系A、细胞系B、细胞系C和细胞系D)已长成绿色小植物，且两个SR愈合组织(细胞系A和细胞系B)已长成可存活植物。A细胞系、B细胞系和D细胞系源自相同细胞系莫纳克亚12JAN08，而C细胞系源自2008年3月4日产生的实验细胞系UGA 03-098E-3。A细胞系就再生植物来说最多产，产生500个以上的个别植物。B细胞系产生约20个植物。

自65个SR细胞系的63个细胞系中获得ACCase扩增子，且仅有3个细胞系，包括细胞系A(图5)显示位置1781上A转变成T。这些SR细胞系中除位置1781或2078以外的位置上也可能发生突变。抗性细胞系对于突变来说是杂合的，因此序列层析谱说明在突变时存在双峰，其中一个峰表示野生型等位基因，且另一峰表示突变等位基因。在产生活的植物的两个细胞系中，仅仅细胞系A具有预期的Ile突变成Leu。下文中给出针对细胞系A所获得的扩增子的遗传序列为SEQ ID NO：5，其中突出和有下划线的密码子指示Ile突变成Leu。细胞系B在位置178l上具有野生型序列。因为稀禾定抗性也可由位置2078上Asp突变成Gly所赋予，所以分析细胞系B的DNA是否存在此突变，但没有一个细胞系具有此突变。细胞系B的稀禾定抗性的性质仍未确定。

500个以上的细胞系A植物已移植到土壤中。无性繁殖细胞系A的再生植物，以经受除草剂测试，从而在全植物水平上确认西杀草抗性的表达。

SEQ ID NO：5

GGCGATTGGGCCGAAGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGA

TACCCCTTTTTCAGTACATTTATCTGACTGAAGAAGATTATGCTCGTATTAGCTCTTC

TGTTATAGCACATAAGCTACAGCTGGACAGCGGTGAAATTAGGTGGATTATTGACT

CTGTTGTGGGCAAGGAGGATGGGCTTGGTGTTGAGAATTTACATGGAAGTGCTGCT

ATTGCCAGTGCTTATTCTAGGGCATACGAGGAGACATTTACACTTACGTTCGTGACT

GGGCGGACTGTAGGAATAGGAGCTTATCTTGCACGACTTGGTATACGGTGCATACA

GCGTCTTGACCAGCCCATTATTTTAACAGGGTTTTCTGCCCTGAACAAGCTTCTTGG

GCGTGAAGTTTACAGCTCCCACATGCAGTTGGGTGGTCCTAAGATCATGGCGACGA

ATGGTGTTGTCCACCTCACTGTTTCAGATGATCTTGAAGGTGTATCCAGTATATTGA

GGTGGCTCAGCTATGTTCCTGCCAACATTGGTGGACCTCTTCCTATTACAAAACCTT

TGGACCCACCGGACAGACCTGTTGCGTACATCCCTGAGAACACATGCGATCCACGT

GCAGCCATCCGTGGTGTAGATGACAGCCAAGGGCAATGGTTGGGTGGTATGTTTGA

CAAAGACAGCTTTGTGGAGACATTTGAAGGATGGGCGAAAACAGTTGTCACTGGCA

GGGCATAGCTTGGAGGAATTCCTGTGGGTGTCATAGCTGTGGAGACACAGAACATG

ATGCAGCTCATCCCTGCTGATCCAGGCCAGCTTGATTCTCATGAGCGATCTGTTCCT

CGGGCTGAACAAGTGTGGTTCCCAGATTCTGCAACCAAGACTGCTCAAGCATTGTT

GGACTTCAACCGTGAAGGATTGCCTCTGTTCATCCTTGCTAACTGGAGAGGTTTCTC

TGGTGGACAAAGAGATCTCTTTGAAGGAATTCTTCAGGCTGGGTCAACAATTGTTG

AGAACCTTAGGACGTACAATCAACCTGCGTTTGTCTACATTCCTATGGCTGGAGAGC

TGCGTGGAGGAGCTTGGGTTGTGGTTGATAGCAAAATAA

含有SEQ ID NO：5的载体于2009年6月寄存于美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)，美国(U.S.A.)弗吉尼亚(Virginia)20110-2209马纳萨斯(Manassas)大学大道10801(10801 University Boulevard)，且寄存编号为________。

实例8

评估对稀禾定(SEGMENT^TM除草剂)的全植物抗性

测试从稀禾定抗性细胞系(A细胞系)再生的稀禾定抗性植物在温室中进行的剂量反应实验中在全植物水平上的抗性。在此实验中，将A细胞系与以下两种除草剂敏感对照株对比：初始亲本株莫纳克亚(PT)，和从组织培养物(TTC)再生的莫纳克亚株。将植物移植到含有1∶1的Fafard

3B混合物与砂的混合物的Cone-tainers^TM(测量为4×1.4cm，并逐渐缩减到1cm；斯图维父子公司(Stuewe and Sons Inc.)，俄勒冈地区科瓦利斯(Corvallis，Oregon))中，并放到温室中的种植台上，处于钠灯下，温室中保持27/32℃白天/黑夜的16小时光周期，持续大约2周，随后施用除草剂处理。使用Segment^TM除草剂(巴斯夫公司(BASF Corp.)，弗伦翰公园(Florham Park)，新泽西州(NJ))，用每公顷0、50、100、200、400、800、1600和3200g活性成分的施用量的稀禾定处理三种基因型A细胞系、PT和TC中的每一种。所有除草剂施用量都是在实验喷洒室中以每公顷1871的喷洒体积应用，且在干燥之后回到温室梯段上并维持在上文所述的条件下。在处理后第7、14、21和28天(DAT)，使用0到100的规模(其中0等于无损害且100等于完全死亡)记录作物损害的可见估算值。在处理后第42天，收获所有植物的地上部分，在50℃的温度下干燥48小时，并称重以确定植物干重。处理是以随机化的完全区组设计安排。因为有限的植物材料，只有两种TCC复制物是可能的，否则四种复制物用于其它两种基因型(PT和A细胞系)。首先使用双因子方差分析来分析数据，随后在除草剂施用量内分析。基因型之间的差异意谓每一种除草剂施用量是使用费雪最小显着差异法(LSD)确定。

图9说明稀禾定施用量对于三种被测试基因型中的每一种在14DAT的损害等级的影响。图11说明稀禾定施用量对于三种被测试基因型中的每一种在21DAT的损害等级的影响。双因子方差分析通过除草剂施用量对处理后第7、14、21和28天的损害等级的影响(数据没有显示)指示显着基因型、除草剂施用量和基因型。A细胞系显示优越的除草剂抗性，即使在每公顷3200g活性成分的最高施用量下(图8，表4)。相比之下，PT和TC在每公顷200g活性成分的施用量下具有30或更大的损害得分，且在等于或大于每公顷800g活性成分的施用量下具有80％或更大的损害得分。当比较三种基因型中的每一种在每一种除草剂施用量下的平均损害得分时，A细胞系在所有评级日期在大于每公顷100g活性成分的所有施用量下具有显着小于PT或TC的损害。在3200g ai ha^-1或对百足草的最低标示施用量15倍剂量下对细胞系A所观测到的最大损伤得分为7.5％，百足草为假俭草(Eremochloa ophiuroides(Munro)Hack)，一种对稀禾定天然耐受的草坪草物种。

图12呈现在42DAT获取的三种基因型的平均干重。两种敏感细胞系PT和TCC的干重回应于稀禾定使用率增加而降低，而CLA的干重即使在大于每公顷1600g活性成分的施用量下仍保持相对稳定。

PT、TC和A细胞系的三种基因型的LD₅₀的估算值是每公顷189、276和＞3200g活性成分。这些数据提供以下证据：细胞系A存在的除草剂抗性水平足够大以有效控制敏感的杂草而无需考虑除草剂损伤。

实例9

对稀禾定(POAST^TM除草剂)具有抗性的全植物的评估

起始第二温室实验，以在全植物水平上评估由第二个稀禾定抗性细胞系B细胞系再生的SR植物的稀禾定抗性。在先前的实验(实例8)中，较高浓度的Segment^TM稀禾定除草剂对A细胞系产生极少损伤。这些损伤的症状更倾向于是表面活性剂的损伤而非稀禾定损伤。因此，选择Poast^TM除草剂(不含表面活性剂的稀禾定调配物)来表征B细胞系的抗性水平，并将B细胞系的稀禾定抗性水平与A细胞系相比较。在本实验中，将A细胞系和B细胞系与以下两种易受除草剂影响的对照组相比较：原始的莫纳克亚亲本细胞系(PT)；和由组织培养再生的莫纳克亚细胞系(TTC)。将植物移植到含有1∶1的Fafard3B混合物与砂的混合物的Cone-tainers^TM(测量为4×1.4cm，并逐渐缩减到1cm；斯图维父子公司(Stuewe and Sons Inc.)，俄勒冈地区科瓦利斯(Corvallis，Oregon))中，并放到温室中的种植台上，处于钠灯下，温室中保持27/32℃白天/黑夜的16小时光周期，持续大约2周，随后施用除草剂处理。

使用Poast^TM除草剂(巴斯夫公司(BASF Corp.)，新泽西州弗洛厄姆帕尔克(Florham Park，NJ))，用0、50、100、200、400、800、1600、3200和6400g ai ha^-1的稀禾定施用量处理四种基因型(A细胞系、B细胞系、PT和TCC)中的每一者。在实验喷雾室中，所有除草剂施用量都以187L ha^-1的喷雾体积施用，干燥后，将植物放回温室中的种植台上，并在上文所述的条件下保持。处理后16、21和28天(DAT)，使用0到100的量表记录下作物损伤的目测估计值，其中0等于无损伤，而100等于完全死亡。本实验为4×9阶乘，即，4种基因型和9种除草剂施用量。处理是布置成随机的完备型设计。所用全部四种基因型都是一式四份。首先使用双因素方差分析(SAS，2008)来分析数据，随后在除草剂施用量范围内进行分析。使用费雪最小显着差异法(LSD)测定在各除草剂施用量下各基因型平均值之间的差异。

图13说明在21DAT时稀禾定施用量对四种所测试的基因型中每一者的损伤等级的影响。双因素方差分析指示显着基因型、除草剂施用量以及在16、21和28DAT时除草剂施用量对基因型损伤等级的影响(数据未显示)。A细胞系和B细胞系显示出优良的除草剂抗性，甚至在6400g ai ha^-1的最高施用量下也是如此(图13)。相比之下，在400g ai ha^-1的施用量下，PT和TCC的损伤评分为27或27以上，而且在1600g ai ha^-1的施用量下，损伤评分为80％或80％以上。当对四种基因型中每一者在每一除草剂施用量下的平均损伤评分进行比较时，在所有等级时期，在高于200g ai ha^-1的所有施用量下，A细胞系和B细胞系的损伤都明显少于PT或TCC。对于高达6400g ai ha^-1的所有施用量，在A细胞系和B细胞系上所观察到的最大损伤评分也低于20％。

对于PT、TC、A细胞系和B细胞系，四种基因型的LD₅₀估计值分别为720、782、＞6400、＞6400g ai ha^-1。这些数据强有力地证实，A细胞系和B细胞系中存在的除草剂抗性水平能够较好地提供对于易受杂草影响的禾草的有效控制，而且不会涉及除草剂损伤。

实例10

稀禾定抗性雀稗属对其它乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的交叉抗药性

稀禾定是称为乙酰辅酶A羧化酶抑制性除草剂类别中的一个成员。这一家族的除草剂通常分为两组，即环己二酮类(cyclohexanedione，CHD)除草剂，以环己烷环为特征，常称为“Dims”；和芳氧苯氧丙酸酯类(aryloxyphenoxypropionate，APP)除草剂，常称为“Fops”。视结构和/或侧链的相似性而定，对稀禾定的抗性可以指示对于乙酰辅酶A羧化酶抑制剂家族中的一大类除草剂的抗性。例如，在具有1781ILE到LEU的突变(最常由稀禾定抗性引起)的数种杂草植物物种中都曾报导过针对CHD和APP除草剂的交叉抗药性(戴尔(Délye)，2005.杂草科学(Weed Science)53：728-746，以全文引用的方式并入本文中)。因此，在一系列温室实验中测定稀禾定抗性A和B细胞系对其它乙酰辅酶A羧化酶抑制性除草剂的抗性。

在本实验中，将A细胞系和B细胞系与以下两种易受除草剂影响的对照组相比较：原始的莫纳克亚亲本细胞系(PT)；和由组织培养再生的莫纳克亚细胞系(TTC)。将植物移植到含有1∶1的Fafard3B混合物与砂的混合物的Cone-tainers^TM(测量为4×14cm，并逐渐缩减到1cm；斯图维父子公司，俄勒冈地区科瓦利斯)中，并放到温室中的种植台上，处于钠灯下，温室中保持27/32℃白天/黑夜的16小时光周期，持续大约2周，随后施用除草剂处理。

在三个独立的除草剂剂量反应实验中，比较四种基因型A细胞系、B细胞系、PT、TCC中每一者。所测试的除草剂包括精吡氟禾草灵(Fusilade II^TM)和精恶唑禾草灵(Acclaim Extra^TM)。在各实验中，利用9种适宜的除草剂施用量处理四种基因型中的每一者(一式四份)。使用Fusilade II^TM除草剂(桑吉塔作物保护公司(Syngenta Crop Protection，Inc.)；北卡罗莱纳州格林斯伯勒(Greensboro，NC))，吡氟禾草灵的施用量为0、25、50、100、200、400、800、1600和3200g ai ha^-1的精吡氟禾草灵施用量。使用Acclaim Extra^TM除草剂(拜尔环境科学公司(Bayer Environmental Science)，新泽西州蒙特韦尔(Montvale，NJ))，恶唑禾草灵的施用量为0、25、50、100、200、400、800、1600和3200g ai ha^-1的精恶唑禾草灵施用量。在实验喷雾室中，所有除草剂施用量都以187L ha^-1的喷雾体积施用，干燥后，将植物放回温室中的种植台上，并在上文所述的条件下保持。处理后21和28天(DAT)，使用0到100的量表记录下作物损伤的目测估计值，其中0等于无损伤，而100等于完全死亡。本实验为4×9阶乘，即，4种基因型和9种除草剂施用量。处理是布置成随机的完备型设计。所用全部四种基因型都是一式四份。首先使用双因素方差分析(SAS，2008)来分析数据，随后在除草剂施用量范围内进行分析。使用费雪最小显着差异法(LSD)测定在各除草剂施用量下各基因型平均值之间的差异。

图14说明在21DAT时吡氟禾草灵施用量对四种所测试的基因型中每一者的损伤等级的影响。双因素方差分析指示显着基因型、除草剂施用量以及在21和28DAT时除草剂施用量对基因型损伤等级的影响(数据未显示)。在高于50g ai ha^-1的所有施用量下，A细胞系和B细胞系所显示的损伤不如PT和TCC显着。对于PT、TC、A细胞系和B细胞系，四种基因型的LD₅₀估计值分别为36、37、800和516g ai ha^-1。这些数据强有力地证实了A细胞系和B细胞系都存在针对吡氟禾草灵的交叉抗药性。所存在的交叉抗药性水平足以提供针对易受杂草影响的禾草的有效控制，而且不会严重涉及到除草剂损伤。

图15说明在21DAT时恶唑禾草灵施用量对四种所测试的基因型中每一者的损伤等级的影响。双因素方差分析指示显着基因型、除草剂施用量以及在21和28DAT时除草剂施用量对基因型损伤等级的影响(数据未显示)。在高于50g ai ha^-1的所有施用量下，A细胞系和B细胞系所显示的损伤不如PT和TCC显着。在本实验中，A细胞系和B细胞系都表现出针对恶唑禾草灵的极高水平的交叉抗药性。在高达1600g ai ha^-1的所有恶唑禾草灵施用量下，A细胞系的损伤不超过20％，而甚至在最高施用量3200g ai ha^-1下，B细胞系的损伤也不超过20％。对于PT、TC、A细胞系和B细胞系，四种基因型的LD₅₀估计值分别为56、22、＞3200和＞3200g ai ha^-1。这些数据强有力地证实了A细胞系和B细胞系都存在针对恶唑禾草灵的交叉抗药性。所存在的交叉抗药性水平能较好地提供针对易受杂草影响的禾草的有效控制，而且不会严重涉及到除草剂损伤。

实例11

在剪股颖属草中稀禾定抗性细胞系的选择

为了诱导形成愈合组织，在用力振荡下，于10％漂白剂中对剪股颖属草的种子表面灭菌，持续4小时。随后将灭菌过的种子放到表5中所述的愈合组织诱导培养基上(罗(Luo)等人，2003.植物细胞报告(Plant Cell Reports)22(9)：645-652，以全文引用的方式并入本文中)。

表5.用于剪股颖属草的愈合组织诱导培养基

一旦从剪股颖属草获得了愈合组织，就如前文所述(实例4)，通过稀禾定选择法筛选这些愈合组织。简单点说，通过将愈合组织放到含有10μM稀禾定的愈合组织诱导培养基(表5)上，来选择稀禾定抗性(SR)细胞。使用大培养板(尺寸为245×245mm)来高效地筛选较多数量的细胞。将直径为约4mm的愈合组织放到15×15的格子中，得到每块培养板总计225个愈合组织。以3周的时间间隔传代培养愈合组织(实例3)，持续总计9周的选择期。将抗药性愈合组织传代培养到含有补充了10μM稀禾定的愈合组织诱导培养基(表5)的100×15mm皮氏培养皿中，培养1个月，以便获得足够的愈合组织。此举将提供总计12周或12周以上的选择时间。

实例12

在剪股颖属草中稀禾定抗性细胞系的再生

一旦获得了稀禾定抗性愈合组织，就尝试使所有抗药性愈合组织再生。所用再生培养基如表6中(罗等人，2003，同上文)所述。

表6.用于剪股颖属草的再生培养基

可以进行所属领域技术人员已知用于再生稀禾定抗性剪股颖属草愈合组织的任何再生方案。例示性再生方案描述于罗等人(2003，同上文)中。另一例示性再生方案描述于实例5中。

实例13

在剪股颖属草中稀禾定抗性细胞系的分子表征

一旦鉴别出稀禾定抗性(SR)剪股颖属草细胞系，就可以表征引起所述抗药性的突变。本文中已经描述了用于鉴别乙酰辅酶A羧化酶基因1781位的突变的例示性方案(实例6)。此外，还可以通过设计引物来扩增包括2027、2041、2078(实例6)和2096位的特定区域，由此分析在剪股颖属草细胞系中乙酰辅酶A羧化酶基因的任何其它位置处的突变(戴尔，2005，同上文)。所属领域技术人员都了解进行序列分析的引物设计和区域扩增方法。

实例14

在剪股颖属草中对稀禾定和乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的抗性的全植物评估

一旦稀禾定抗性剪股颖属草植物再生，就如本文所述进行稀禾定抗性的全植物评估(实例8和9)。此外，也如本文所述进行对其它乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的交叉抗药性评估(实例10)。

实例15

高羊茅草中愈合组织的诱导

为了诱导形成愈合组织，在50％硫酸中对高羊茅草的种子进行灭菌，持续30分钟，用去离子水和95％乙醇冲洗，并在含有0.1％吐温(tween)的100％漂白剂中搅拌30分钟。随后，在无菌水中冲洗种子10次，每次4分钟。灭菌后，就将种子放到MS/B5D2培养基上(村重(Murashige)和斯科格(Skoog.)1962，同上文；甘博格(Gamborg)等人，1968.同上文)以供萌芽。1周后，通过切开种子来使所有萌芽的种子损伤，由此促进愈合组织生长。将切开的种子放到愈合组织诱导培养基(如表7中所述)上，以诱导形成愈合组织。每2周转移愈合组织，以便繁殖用于接下来的实验。

表7.用于高羊茅草的愈合组织诱导培养基

组分	浓度(每升培养基)
		MS基础盐	(村重(Murashige)和斯科格(Skoog.)1962，同上文)
B5维生素	(甘博格(Gamborg)等人，1968.同上文)

蔗糖	30mg
		2，4-D	5mg
6-苯甲基氨基嘌呤(BAP)	0.15mg
		Gelzan^TM	3g

实例16

在高羊茅草稀禾定抗性细胞系的选择

一旦从高羊茅草获得了愈合组织，就如前文所述(实例4)，通过稀禾定选择法筛选这些愈合组织。简单点说，通过将愈合组织放到含有10μM稀禾定的愈合组织诱导培养基(表7)上，来选择稀禾定抗性(SR)细胞。使用大培养板(尺寸为245×245mm)来高效地筛选较多数量的细胞。将直径为约4mm的愈合组织放到15×15的格子中，得到每块培养板总计200到250个愈合组织。以2周的时间间隔传代培养愈合组织3次(实例3)。将抗药性愈合组织传代培养到含有补充了10μM稀禾定的愈合组织诱导培养基(表7)的100×15mm皮氏培养皿中，并繁殖至少1个月，以便获得足够的愈合组织。

实例17

在高羊茅草中稀禾定抗性细胞系中的再生

一旦获得了稀禾定抗性愈合组织，就尝试使所有抗药性愈合组织再生。可以使用如表6中(罗等人，2003，同上文)所述的再生培养基。另一例示性再生方案描述于实例5中。但也可以进行所属领域技术人员已知用于再生稀禾定抗性高羊茅草愈合组织的任何再生方案。

实例18

在高羊茅草中稀禾定抗性细胞系的分子表征

一旦鉴别出稀禾定抗性(SR)高羊茅草细胞系，就可以表征引起所述抗药性的突变。本文中已经描述了用于鉴别乙酰辅酶A羧化酶基因1781位的突变的例示性方案(实例6)。此外，还可以通过设计引物来扩增包括2027、2041、2078(实例6)和2096位的特定区域，由此分析在高羊茅草细胞系中乙酰辅酶A羧化酶基因的任何其它位置处的突变(戴尔，2005，同上文)。所属领域技术人员都了解进行序列分析的引物设计和区域扩增方法。

实例19

在高羊茅草中对稀禾定和乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的抗性的全植物评估

一旦稀禾定抗性高羊茅草植物再生，就如本文所述进行稀禾定抗性全植物的评估(实例8和9)。此外，也如本文所述进行对其它乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的交叉抗药性评估(实例10)。

实例20

在结缕草中稀禾定抗性细胞系的选择

为了诱导形成愈合组织，在50％硫酸中对结缕草的种子进行灭菌，持续30分钟，用去离子水和95％乙醇冲洗，并在含有0.1％吐温的100％漂白剂中搅拌30分钟。随后，在无菌水中冲洗种子10次，每次4分钟。灭菌后，就将种子放到MS/B5D2培养基上(村重(Murashige)和斯科格(Skoog.)1962，同上文；甘博格(Gamborg)等人，1968.同上文)以供萌芽。1周后，通过切开种子来使所有萌芽的种子损伤，由此促进愈合组织生长。将切开的种子放到愈合组织诱导培养基(如表7中所述)上，以诱导形成愈合组织。每2周转移愈合组织，以便繁殖用于接下来的实验。

实例21

在结缕草中稀禾定抗性细胞系的选择

一旦从结缕草获得了愈合组织，就如前文所述(实例4)，通过稀禾定选择法筛选这些愈合组织。简单点说，通过将愈合组织放到含有10μM稀禾定的愈合组织诱导培养基(表7)上，来选择稀禾定抗性(SR)细胞。使用大培养板(尺寸为245×245mm)来高效地筛选较多数量的细胞。将直径为约4mm的愈合组织放到15×15的格子中，得到每块培养板总计200到250个愈合组织。以2周的时间间隔传代培养愈合组织3次(实例3)。将抗药性愈合组织传代培养到含有补充了10μM稀禾定的愈合组织诱导培养基(表7)的100×15mm皮氏培养皿中，并繁殖至少1个月，以便获得足够的愈合组织。

实例22

在结缕草中稀禾定抗性细胞系的再生

一旦获得了稀禾定抗性愈合组织，就尝试使所有抗药性愈合组织再生。可以使用如表6中(罗等人，2003，同上文)所述的再生培养基。另一例示性再生方案描述于实例5中。但也可以进行所属领域技术人员已知用于再生稀禾定抗性结缕草愈合组织的任何再生方案。

实例23

在高羊茅草中稀禾定抗性细胞系的分子表征

实例24

在结缕草中对稀禾定和乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的抗性的全植物评估

一旦稀禾定抗性结缕草植物再生，就如本文所述进行稀禾定抗性全植物的评估(实例8和9)。此外，也如本文所述进行对其它乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂的交叉抗药性评估(实例10)。

实例25

通过施用除草剂控制除草剂抗性植物间的杂草种类

每周1次用150g a.i.ha^-1稀禾定处理一小块含有狗牙根和稀禾定抗性海滨雀稗的土地，持续3个月的时间。在3个月的处理期中，观察到，狗牙根慢慢地灭绝，而稀禾定抗性雀稗持续茁壮成长，在这块土地上留下繁殖超过80％的稀禾定抗性雀稗。

实例26

通过施用组合除草剂控制除草剂抗性植物间的杂草种类

每周1次用150g a.i.ha^-1稀禾定和150g a.i.ha^-1恶唑禾草灵处理一小块含有狗牙草和稀禾定抗性海滨雀稗的土地，持续3个月的时间。在3个月的处理期中，观察到，狗牙根慢慢地灭绝，而稀禾定抗性雀稗持续茁壮成长，在这块土地上留下繁殖超过80％的稀禾定抗性雀稗。

实例27

标记辅助的选择：使用除草剂抗性作为标记来鉴别适于选择的性状

如本文所述(参看实例15-19)培养具有育种目的所需的数种性状的高羊茅草品种，以鉴别所述品种的稀禾定抗性愈合组织细胞系。使这些细胞系再生成一代成熟的植物R₀。将具有乙酰辅酶A羧化酶I1781L突变(赋予稀禾定抗性)的R₀植物与缺乏所述数种性状的不同高羊茅草品种杂交。经过接下来的杂交，某些符合需要的性状显示为非随机地与稀禾定抗性分离。经过进一步的任选杂交，可定性稀禾定抗性与各相关性状之间的关联。对于发现与稀禾定抗性有关的每一性状，所述抗性是适用于标记辅助的育种/选择方案的标记。

实例28

标记辅助的选择：根据标记表型选择符合需要的相关性状

使用来自实例27的R₀代或此代植物的子代的稀禾定抗性高羊茅草植物进行标记辅助的育种和选择。将市售的缺乏实例27中所鉴别的相关性状中的一者的高羊茅草品种与来自实例27的稀禾定抗性高羊茅草植物杂交，以形成杂交代。使杂交代的种子萌芽，并用足以杀死或严重延迟非抗药性植物生长的量的稀禾定处理植物。选择健康的稀禾定抗性植物进行进一步杂交。大量的所述所选植物都携带相关性状。使稀禾定抗性植物与市售品种的植物进一步交叉传代，随后用稀禾定处理和选择，产生实质上具有所述市售品种的遗传背景但携带确定与稀禾定抗性相关的符合需要的性状的植株。

实例29

标记辅助的选择：根据分子标记选择符合需要的相关性状

使用来自实例27的R₀代或此代植物的子代的稀禾定抗性高羊茅草植物进行标记辅助的育种和选择。将市售的缺乏实例27中所鉴别的相关性状中的一者的高羊茅草品种与来自实例27的稀禾定抗性高羊茅草植物杂交，以形成杂交代。使杂交代的种子萌芽，并借助分子方法(例如PCR)针对与I1781L突变相关的SNP的存在筛选来自萌芽植物的样品。例如，可以在扩增分析中使用SV384F和SV384R引物(实例6，SEQ ID NO：1和2)来检测标记。杂交植物中分子标记的存在证实了杂交植物也携带与稀禾定抗性有关的符合需要的性状的可能性，如实例27中所论述。选择携带分子标记的植物进行进一步杂交。大量的所述所选植物都携带相关性状。使具有所述标记的植物与市售品种的植物进一步交叉传代，随后进行进一步分子选择或通过稀禾定处理和选择，产生实质上具有所述市售品种的遗传背景但携带确定与稀禾定抗性相关的符合需要的性状的植株。

上文描述的各种方法和技术提供了多种方式来进行本发明。此外，所属领域技术人员将认识到来自不同实施例的各种特征的适用性。类似地，所属领域技术人员可组合和/或修改上文论述的各种要素、特征和步骤以及各所述要素、特征或步骤的其它已知的等效物，以便执行根据本发明的原理的方法。在不同实施例中将特别地包括各种要素、特征和步骤中的一部分，并特别地排除其它的要素、特征和步骤。

尽管已经在某些实施例和实例的内容中揭示了本发明，但所属领域技术人员应了解，本发明的实施例可超出特别揭示的实施例而扩展到其它替代性实施例和/或用途和修改以及其等效物。

在本发明的实施例中已经揭示了许多变更和替代性要素。所属领域技术人员将显而易见其它变更和替代性要素。

在一些实施例中，术语“一”和“所述”以及在描述本发明的某一特定实施例的上下文(尤其是在以下某些权利要求的上下文)中使用的类似参考物都可解释为涵盖单数和复数形式。本文中有关数字的范围的叙述仅打算用作个别地指示每一单独值在所述范围内的简写方法。除非本文中另作指示，否则各个别值都被并入本说明书中，就如同本文个别地叙述每一值一样。除非在本文中另作指示或上下文另外明确地相反指示，否则本文所述的所有方法可以任何次序执行。除非另外声明，否则在本文的某些实施例中提供的任何实例和所有实例或示范性术语(例如，“例如”)的使用都仅打算用于更好地说明本发明，并且不形成对本发明的范围的限制。不应将本说明书中的术语解释为指示任何非所主张的要素为实践本发明所必需的。

本文中揭示的替代性要素或实施例的分组不应解释为限制。各组的成员都可个别地提及和主张，或与所述组的其它成员或者本文所述的其它要素以任何组合形式提及和主张。为便利和/或可专利性起见，一个组的一个或一个以上成员都可包括在一个组中或从一组中缺失。当出现任何此类纳入或缺失时，本说明书在本文中应视为含有如此修改的群组，由此满足所附权利要求书中使用的所有马库西群组(Markush group)的书面描述。

本文描述了本发明的优选实施例，包括发明者已知的用于进行本发明的最佳模式。所属领域技术人员在阅读了前述描述后，将即刻了解针对这些优选实施例的变更。预期所属领域技术人员可在适当时使用所述变更，而且本发明可以不同于本文特别描述的方式实践。因此，本发明的许多实施例包括适用法律所允许的针对附加权利要求书中所述的发明主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另作指示或上下文另外明确地作相反指示，否则本发明涵盖上述要素的所有可能的变更的任何组合。

而且，在本说明书全文引用了多项专利和印刷的出版物。上述参考文献和印刷的出版物中每一者都是以全文引用的方式个别地并入本文中。

最后，应了解，本文揭示的本发明的实施例是对本发明原理的说明。可以使用的其它修改都在本发明的范围内。因此，例如(但不限于)，可以根据本文的教示而利用本发明的替代性配置。因此，本发明的实施例不限于所显示和描述者。

Claims

1.一种选择和培养的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其来自黍亚科(Panicodae)群或其组织、种子或子代。

2.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其由经受选择方法的除草剂抗性未分化细胞再生，其中所述选择方法包含：

提供来自所述黍亚科群的植物的未分化细胞的愈合组织；

使所述愈合组织与至少一种足以延缓所述愈合组织生长或杀死所述愈合组织的量的除草剂接触；

基于所述除草剂的差别作用，选择至少一个抗性细胞；和

由所述至少一个抗性细胞再生所述种类的活的全植物。

3.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物为黍族(tribe Paniceae)的成员。

4.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物为选自以下群组的一种：地毯草属(Axonopus)(地毯草(carpetgrass))、马唐属(Digiteria)(马唐草(Crabgrass))、稗属(Echinochloa)、黍属(Panicum)、雀稗属(Paspalum)(百喜草(Bahiagrass))、狼尾草属(Pennisetum)、狗尾草属(Setaria)和钝叶草属(Stenotaphrum)(圣奥古斯丁草(St.Augustine grass))。

5.根据权利要求3所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物为选自以下群组的一种：海滨雀稗(seashore paspalum)(海雀稗(P.vaginatum))、剪股颖属草(bent grass)、高羊茅草(tall fescue grass)、结缕草(Zoysiagrass)、狗牙根(bermudagrass)(狗牙根属(Cynodon spp))、草地早熟禾(Kentucky Bluegrass)、得克萨斯早熟禾(Texas Bluegrass)、黑麦草(Perennial ryegrass)、野牛草(buffalograss/Buchloe dactyloides)、百足草(centipede grass)(假俭草(Eremochloa ophiuroides))和圣奥古斯丁草(偏序钝叶草(Stenotaphrum secundatum))、地毯草(地毯草属)和百喜草(Bahiagrass/Paspalum notatum)。

6.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物对乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂有抗性。

7.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物对环己二酮(cyclohexanedione)除草剂、芳氧基苯氧基丙酸酯(aryloxyphenoxy proprionate)除草剂、苯基吡唑啉(phenylpyrazoline)除草剂或其混合物有抗性。

8.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述除草剂抗性是由选自以下群组的乙酰辅酶A羧化酶基因的至少一个氨基酸位置上的突变所赋予：1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099和2096。

9.根据权利要求8所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述除草剂抗性是由氨基酸位置1781上异亮氨酸突变成亮氨酸所赋予。

10.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物对至少一种选自以下群组的除草剂有抗性：禾草灭(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、氯丙氧定(cloproxydim)、环苯草酮(profoxydim)、稀禾定(sethoxydim)、环苯草酮(clefoxydim)、克草同(clethodim)、环杀草(cycloxydim)、得杀草(tepraloxydim)、苯草酮(tralkoxydim)、炔禾灵(chloraizfop)、炔草酸(clodinafop)、氯伏草(clofop)、赛伏草(cyhalofop)、禾草灵(diclofop)、精恶唑禾草灵(fenoxaprop)、噻唑禾草灵(fenthiaprop)、精吡氟禾草灵(fluazafop-butyl)、吡氟禾草灵(fluazifop)、合氯氟(haloxyfop)、异恶草醚(isoxapyrifop)、恶唑酰草胺(metamifop)、普拔草(propaquizafop)、快伏草(quizalofop)、三氟丙酸(trifop)和唑啉草酯(pinoxaden)。

11.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物，其中所述植物为非转基因植物。

12.一种根据权利要求1至11中任一权利要求所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物的子代。

13.根据权利要求12所述的子代，其中所述子代为所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物亲本株有性繁殖的结果。

14.根据权利要求12所述的子代，其中所述子代为所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物亲本株无性繁殖的结果。

15.一种根据权利要求1至11中任一权利要求所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物的种子。

16.一种根据权利要求12所述的子代的种子。

17.一种根据权利要求13所述的子代的种子。

18.一种根据权利要求14所述的子代的种子。

19.一种草皮，其包含根据权利要求1至11中任一权利要求所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物或其子代或种子。

20.一种草皮草苗圃地，其包含根据权利要求1至11中任一权利要求所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物或其子代或种子。

21.一种商用草地、高尔夫球场或田野，其包含根据权利要求1至11中任一权利要求所述的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性植物或其子代或种子。

22.一种鉴别来自黍亚科群的除草剂抗性植物的方法，其包含：

提供来自所述黍亚科群的植物的未分化细胞的愈合组织；

基于所述除草剂的差别作用，选择至少一个抗性细胞；和

由所述至少一个抗性细胞再生所述种类的活的全植物，

其中所述再生植物对所述至少一种除草剂有抗性。

23.根据权利要求22所述的方法，其另外包含将所述至少一个抗性细胞扩大至多个未分化细胞。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物为选自黍族的一种。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述植物为选自以下群组的一种：地毯草属(地毯草)、马唐属(马唐草)、稗属、黍属、雀稗属(百喜草)、狼尾草属、狗尾草属和钝叶草属(圣奥古斯丁草)。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述植物为选自以下群组的一种：海滨雀稗(海雀稗)、剪股颖属草(剪股颖属(Agrostis spp))、高羊茅草、结缕草、狗牙根(狗牙根属)、草地早熟禾、得克萨斯早熟禾、黑麦草、野牛草、百足草(假俭草)和圣奥古斯丁草(偏序钝叶草)、地毯草(地毯草属)和百喜草。

27.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种除草剂为乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述除草剂抗性是由选自以下群组的乙酰辅酶A羧化酶基因的至少一个氨基酸位置上的突变所赋予：1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099和2096。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述除草剂抗性是由氨基酸位置1781上异亮氨酸突变成亮氨酸所赋予。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种除草剂选自以下群组：禾草灭、丁苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、精恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。

31.根据权利要求22所述的方法，其中未分化细胞的所述愈合组织由非转基因植物提供。

32.一种通过根据权利要求22所述的方法鉴别的除草剂抗性植物的可再生细胞的组织培养物。

33.一种控制通过根据权利要求22所述的方法鉴别的除草剂抗性植物附近的杂草的方法，其包含：使至少一种除草剂与所述杂草和所述除草剂抗性植物接触，其中所述至少一种除草剂以足以抑制同一物种的未选择植物生长或足以抑制所述杂草生长的施用量与所述杂草和所述植物接触。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述除草剂抗性植物对乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂有抗性。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述除草剂抗性植物对环己二酮除草剂、芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂、苯基吡唑啉除草剂或其混合物有抗性。

36.根据权利要求33所述的方法，其中所述植物中的所述除草剂抗性是由选自以下群组的乙酰辅酶A羧化酶基因的至少一个氨基酸位置上的突变所赋予：1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099和2096。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述除草剂抗性是由所述乙酰辅酶A羧化酶基因的氨基酸位置1781上异亮氨酸突变成亮氨酸所赋予。

38.根据权利要求33所述的方法，其中所述至少一种除草剂选自以下群组：禾草灭、丁苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、精恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。

39.根据权利要求33所述的方法，其中所述除草剂抗性植物为非转基因植物。

40.根据权利要求33所述的方法，其包含使所述除草剂直接与所述除草剂抗性植物接触。

41.根据权利要求33所述的方法，其包含使所述除草剂与所述除草剂抗性植物所处的生长培养基接触。

42.一种寄存为ATCC寄存编号______的海滨雀稗特异性DNA标记物或其片段，其能够鉴别除草剂抗性草栽培品种。

43.一种鉴别除草剂抗性植物的方法，其包含：获得植物的遗传样品；和

分析所述样品中是否存在乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781上的突变，其中位置1781上存在突变表明所述植物具有除草剂抗性。

44.一种乙酰辅酶A羧化酶的位置1781上的标记物的用途，其用于鉴别除草剂抗性植物的方法中。

45.一种标记物辅助的培育方法，其包含以下步骤：

鉴别用于培育和选择的相关特征，其中所述特征与乙酰辅酶A羧化酶基因有关联；

提供携带能够赋予所述植物乙酰辅酶A羧化酶抑制剂除草剂抗性的乙酰辅酶A羧化酶序列变异体的第一植物，其中所述植物另外包含所述相关特征；

将所述第一植物与第二植物一起培育；

鉴别所述培育步骤中具有所述乙酰辅酶A羧化酶序列变异体的子代；和

基于所述鉴别步骤，选择可能具有所述相关特征的子代。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述特征选自性状或基因。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述性状为选自由以下组成的群组的至少一种：除草剂耐性，抗病性，抗虫性，脂肪酸、蛋白质或碳水化合物代谢改变，生长速度提高，胁迫耐性增强，优选的成熟，感官性质增强，地貌特征改变，无菌，其他农业性状，工业用途的性状，或提高消费者吸引力的性状。

48.根据权利要求45所述的方法，其中所述乙酰辅酶A羧化酶序列变异体包含至少一个以下位置的变异：1756、1781、1999、2027、2041、2078、2099和2096。

49.根据权利要求45所述的方法，其中所述除草剂选自：禾草灭、丁苯草酮、氯丙氧定、环苯草酮、稀禾定、环苯草酮、克草同、环杀草、得杀草、苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯伏草、赛伏草、禾草灵、精恶唑禾草灵、噻唑禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟禾草灵、合氯氟、异恶草醚、恶唑酰草胺、普拔草、快伏草、三氟丙酸和唑啉草酯。

50.根据权利要求45所述的方法，其中所述鉴别步骤包含选自以下的方法：序列变异体的分子检测、观测对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的抗性、和通过应用乙酰辅酶A羧化酶抑制剂来选择。

51.一种转基因植物，其经源于SEQ ID NO：5的包含至少250个碱基的DNA区段转化。

52.一种根据权利要求51所述的植物的子代植物。

53.根据权利要求52所述的子代植物，其中所述子代选自回交子代、杂种、克隆子代和同胞交配子代。

54.一种转化细胞，其含有源于SEQ ID NO：5的包含至少250个碱基的DNA区段。

55.一种鉴别细胞中乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781上的突变的方法，其包含：

从细胞获得遗传样品；

通过在扩增步骤中使用SV384F引物和SV348R引物，选择性地扩增DNA片段；和

对所述DNA片段测序，以确定所述乙酰辅酶A羧化酶基因的位置1781上是否存在突变，

其中所述DNA片段中存在突变表明所述细胞中位置1781上存在所述突变。